RAGEにより誘導される骨肉腫幹細胞モデルの確立とその分子機構の解明

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K10435
• Research Institution: Kanazawa University
• Principal Investigator: 武内 章彦 金沢大学, 医学系, 助教 (70512218)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 山本 靖彦 金沢大学, 医学系, 教授 (20313637)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 骨肉腫 / 幹細胞 / 糖化蛋白受容体

Outline of Annual Research Achievements

RAGE過剰発現ヒト骨肉種細胞株（HOS-RAGE細胞株）と対称のmock導入ヒト骨肉種細胞株（HOS-mock細胞株）において、平成23-25年度に若手B研究によりHOS-RAGE細胞株では、Genechipによる発現遺伝子解析で有意に変化する遺伝子（主に細胞周期に関わるもの）を複数見出したが、spheroidを形成した状態がより幹細胞の性質に近いと考え、その条件を用いて、網羅的miRNA解析を施行した。
HOS-RAGE細胞株とHOS-mock細胞株をUltra Low Attachment Culture Dishで培養し、HOS-RAGE細胞株はspheroidからRNAを精製した。HOS-mock細胞株はspheroidを形成せず、接着細胞からRNAを精製した。これらをNEXTflex Small RNA-Seq kit v3を使用し、イルミナ社のプロトコールに従って149~156bpのライブラリーを作成。 Multiplex法によるシーケンス解析を行い、その後バイオインフォマティクス解析をしクラスタリング解析およびヒートマップの作成を施行。その結果有意に増加するmiRNAと低下するmiRNAを30個見いだすことができた。平成27年度に網羅的遺伝子解析で見出した遺伝子と関連性があるものもピックアップされており、さらに、他の癌腫で幹細胞での発現が報告されているものもピックアップされた。その中にはRAGEに関わることがすでに報告されているものも見出された。各miRNAの機能について、文献報告を含めて検索中である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

予定通り、平成28年度はmiRNAの網羅的解析を実施し、新たに興味深いmiRNAの発現をとらえることが出来た。RAGEによって、これらの癌関連あるいは幹細胞に関連するmiRNAの発現を誘導するという報告はなく、新たな知見がえられつつあると考える。よって、おおむね順調に進展していると判断した。

Strategy for Future Research Activity

平成29年度は、平成２8年度にmiRNAのGenechipで見出している標的miRNAの発現をRealtime PCR (rt-PCR)で解析する。miRNAの標的となる遺伝子をsiRNAあるいはshRNA法を用いたHOS-RAGE細胞株の標的遺伝子ノックダウンによって肉腫幹細胞形質消失を指標に遺伝子を絞り込みを行う。さらに、同定された標的遺伝子の機能解析として標的遺伝子をHOS-mock細胞株に導入し肉腫幹細胞の形成が生じるかを解析する。さらにSCIDマウス移植による腫瘍形成・転移能を解析し、肉腫幹細胞の形質を有するか、つまり肉腫幹細胞への形質転換が生じるかを確認する。

Causes of Carryover

動物実験、病理検体の解析を次年度にずらしたため、次年度使用額が生じたが全体の計画には変更はない。

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度の動物実験、病理検体解析に使用する予定する予定である。