2016 Fiscal Year Research-status Report
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15K10453
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University of Medicine |
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Principal Investigator |
藤原 浩芳 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (90381962)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小田 良 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (80516469)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 概日リズム / 体内時計 / 骨折修復 / 発行イメージング / PTH / 温度補償性 / 骨折モデル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Per2は概日リズムを実現する体内時計を構成する時計遺伝子の一つである。このPer2に発光レポーターを導入し、PER2タンパク質と蛍ルシフェラーゼ（Luc）との融合タンパク質をつくる遺伝子改変マウス（Per2::Lucマウス）は体内時計の状態を評価するために広く用いられている。Per2::Lucマウスを用いることで体内時計の状態を発光としてとらえることができる。本研究ではPer2::lucマウスの大腿骨に骨切りを行ったマウス大腿骨骨折モデルを作成し、独自に設計した創外固定器を用いることで骨折部の治癒過程を経時的に観察が可能な実験系を構築した。術後の経時的な組織染色および単純X線像では骨癒合が経時的に進行していたことから骨折の評価として本実験系が骨折および骨折修復の治癒過程の評価系として適当であることが示された。また術後14日目の大腿骨を採取し器官培養下で発光測定を行い、成長軟骨板とともに骨折部にもに明瞭な概日リズムが存在することを明らかにした。これらの結果から、治癒過程の骨折部に体内時計が存在することが示された。また骨折部の体内時計の同調機構に関与していると考えられている副甲状腺ホルモン（PTH）に機能について解明するため、PTH投与によるリズムの位相変化について検討したところ、PTHの投与によりリズムの位相は変化した。PTH受容体抗体を用いて行った免疫染色では、骨折部にPTH受容体の発現を認めたことから骨折の治癒過程ではPTHが時刻の制御因子の一つであることを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
大腿骨器官培養系を用いた継時的な発光イメージングによる実験系で骨折部自体そしてその治癒過程における体内時計の存在を明らかにした。さらに、独自の創外固定器を設計し、既存の物品を用いた簡便な手術手技（骨切り）によるマウス骨折モデル作製を可能とした。このモデルを使用することにより、器官培養系を用いた発光イメージングで、世界で初めて骨折部に内在する体内時計の観察に成功した。また、PTH投与により大腿骨骨折治癒部に見られた発光リズムがPTH投与によって位相変位することを明らかにし、骨折部におけるPTHの体内時計に対する作用について、その機能の一端を明らかにした。以上のことから研究は概ね順調に進展していると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成29年度には、これまでの実験系の良さをふまえながらより骨折および骨折治癒過程の評価に適切な実験系の確立を目指すとともに引き続き生体内での骨折の治癒過程における体内時計の機能の評価を試みる。このために時計遺伝子の中でも重要な役割を果たすBmal1に着目し、骨折部での体内時計の機能解析のために、Per2::LucマウスとBmal1ノックアウトマウスを交配したマウスを用いて骨折モデルを作製し、解析および評価を引き続き行う予定である。術直後および1週おきに麻酔下に単純X線撮影を行い、生体での骨折修復の状態を画像評価する。また、大腿骨を採取し、骨折修復についての組織学的な検討についても継続して行い、採取時期の適切なタイミングについてもさらなる検討を行う予定である。これらin vivoの実験系で安定した結果を得ることができれば細胞株を用いて分子生物学的手法を用いてin vitroでの評価を行うことを予定している。
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