2015 Fiscal Year Research-status Report
ステロイド誘発骨壊死分子機構の実証：Cre依存性細胞特異的遺伝子欠損マウスの応用
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15K10497
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| Research Institution | Kanazawa Medical University |
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Principal Investigator |
市堰 徹 金沢医科大学, 医学部, 准教授 (30307631)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岡崎 俊朗 金沢医科大学, 医学部, 教授 (40233308)
上田 善道 金沢医科大学, 医学部, 教授 (50271375)
植田 修右 金沢医科大学, 医学部, 助教 (10759583)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 特異的スフィンゴミエリン合成酵素欠損マウス / ステロイド / 血管内皮細胞 / 骨細胞 / 骨芽細胞 / SM-1 / SM-2 / 遺伝子改変マウス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
各細胞特異的遺伝子欠損マウスでのステロイド短期大量投与大腿骨壊死量の比較検討とVEGF, BMPs, G-CSFによるリバース効果の検討。
実験動物は血管内皮細胞、骨・骨芽細胞、マクロファージ各細胞特異的スフィンゴミエリン合成酵素欠損マウスを用いて、SMS-2遺伝子欠損マウス（非致死）にSMS-1遺伝子（この遺伝子欠損マウスは致死性）両端にジーンターゲティング法によりloxP配列を挿入しlox-flanked codition alleleを有する遺伝子改変マウスを作製した。
骨芽細胞における SMS-1/SMM-2の機能解析：骨芽細胞における SMS-1/SMS-2の働きに関するデータはなく、ステロイド短期大量投与大腿骨壊死における SMS-1/SMS-2の役割の解析の基礎データとして、骨芽細胞におけるSMS-1/SMM-2の in vitroでの機能解析を行ない、以下の成績を得た。
1)SMS-1/SMS-2コンディショニングダブルノックアウトマウスは、pigmy mouse化を認めた。SMS-1及び SMS-2のコンディショナルノックアウトは、野生型との差異は認めなかった。2)SMS-1/SMS-2ダブルノックアウトマウスの組織学的検討により、長管骨と脊椎の成長板での骨芽細胞の配列異常による骨組織の低形成を認めた。3)骨芽細胞の機能におけるスフィンゴミエリンの関与が初めて明らかになった。4)骨芽細胞の増殖、基質接着能、移動能におけるスフィンゴミエリンの in vitroにおける詳細な機能解析を、マウス間葉系組織幹細胞から分化誘導した骨芽細胞と樹立マウス骨芽細胞における SMS-1/SMS-2遺伝子の siRNA実験とSMS-1/SMS-2ノッカウトマウスから培養した骨芽細胞への SMS-a/SMS-2遺伝子のリバース実験による確認を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
モデルの作成に難渋し、時間を要しているため。
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| Strategy for Future Research Activity |
各マウスからの培養血管内皮と骨芽細胞を用いたステロイドと酸化ストレスによるアポトーシス、細胞増殖、ECM産生、移動能への影響とリバース効果の解析。
血管内皮細胞及び骨・骨芽細胞特異的スフィンゴミエリン酵素欠損マウスから血管内皮細胞、骨芽細胞を各々採取し培養する。対照として遺伝子非欠損マウスの血管内皮細胞、骨芽細胞を同様に培養する。抗CD31、ALP抗体を用いた蛍光抗体法により細胞性格と純度を確認する。培養液へのmethylpredonisolone高濃度投与(500nM)による血管内皮細胞(SM-1 -/-, SM-2 -/-)、血管内皮細胞(SM-1 +/+, SM-2 +/+)、骨芽細胞(SM-1 -/-, SM-2 -/-)、骨芽細胞(SM-1 +/+, SM-2 +/+)のアポトーシス、細胞増殖、細胞移動能、EMC産生能の解析を行う。対照としてmethylpredinisolone非投与群を用いて行う。同時に既存の本疾患動物モデルであるステロイド投与ウサギで、ターゲットとなりうる蛋白などをvivoで検討を行う。
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Research Products
(24 results)
