2016 Fiscal Year Research-status Report

ウサギで再現する長期透析後萎縮膀胱の腎移植後回復：再生医療への分子生物学的研究

Research Project

Project/Area Number	15K10617
Research Institution	Akita University
Principal Investigator	井上高光秋田大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (60375243)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	河谷正仁秋田大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (00177700) 西島和俊秋田大学, バイオサイエンス教育・研究サポートセンター, 准教授 (70435874) 齋藤満秋田大学, 医学部, 講師 (80400505)
Project Period (FY)	2015-04-01 – 2018-03-31
Keywords	膀胱の廃用性萎縮 / 低コンプライアンス / 膀胱機能の回復
Outline of Annual Research Achievements	＜目的＞長期透析患者では膀胱の廃用性萎縮が起こり、低コンプライアンス膀胱となる。しかし腎移植によって尿の流入が再開すると、膀胱機能はほぼ正常に回復する。この分子生物学的メカニズムの解明を目指し、我々はウサギを用いた長期透析萎縮膀胱の腎移植後回復モデルを作成した。＜方法＞週齢18週から26週、体重3kg以上の日本白色種の雌ウサギを用いた。全身麻酔での開腹下に尿道から膀胱内にダブルルーメンカテーテルを挿入し、生理食塩水を注入することで膀胱内圧と膀胱容量を測定し、膀胱コンプライアンスを算出した。その後両側の尿管を膀胱から切離し、膣へと新吻合する尿路変更を行うことで膀胱内を無尿の状態にした。2か月後に再度膀胱コンプライアンスを測定して膀胱の廃用性萎縮を確認したのち、片側尿管を膣から再度膀胱へ再吻合する手術を行った。さらに6週間後に膀胱コンプライアンス測定を行い、膀胱機能の回復を確認した。その時点でウサギを安楽死とし、膀胱組織を採取した。＜結果＞初回測定時（n = 28）、萎縮膀胱時（n = 11）、機能回復時（n = 6）の平均膀胱容量はそれぞれ65 ± 28 ml、17 ± 5ml、32 ± 7mlであり、平均膀胱コンプライアンスは13.1 ± 5.6 ml/cmH2O、3.3 ± 2.0 ml/cmH2O、6.8 ± 2.2 ml/cmH2Oであった。膀胱コンプライアンスは尿路変更の前後で有意に悪化しており（p < 0.001）、尿の流入が再開した後では有意に改善していた（p = 0.004）。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 本研究課題の進捗状況については、やや遅れていると考えている。ウサギの廃用性萎縮膀胱モデルは早期に作成できたが、予想外にウサギの死亡率が高く、効率よく検体採取がしにくかったことが大きな理由である。
Strategy for Future Research Activity	上記で採取した検体をパラフィン包埋し、まず形態学的検討を行う。コントロール膀胱から廃用性萎縮膀胱では何がどのように萎縮、減量しているのか検討する。また膀胱回復過程では線維組織優位な構造からどのように平滑筋が再構築されるのか、また神経密度は回復するかについても検討する。次に凍結しておいた代表的個体から採取した検体のTRIZOL処理を経て、アジレント社から発売されているmRNAマイクロアレイを行う。粘膜と筋層に分けてコントロール(Sham)群、萎縮膀胱群、萎縮膀胱回復群の3群で比較を行う。発現量の変化が著しく、分子生物学的に有望と考えられる遺伝子について5例ずつRT-PCRで検証を行う。できればコントロール(Sham)群、萎縮膀胱群、萎縮膀胱回復群の3群でプロテオーム解析を行う。上記マイクロアレイと関連する結果が得られ、ウサギ遺伝子産物に対する抗体が入手可能であればImmunoblottingで検証を行う。また実験6として将来的には神経損傷有無による差も見ることが出来るかもしれない。
Causes of Carryover	本研究課題の進捗状況については、やや遅れていると考えている。ウサギの廃用性萎縮膀胱モデルは早期に作成できたが、予想外にウサギの死亡率が高く、効率よく検体採取がしにくかったことが大きな理由である。そのため、高額になると考えられるウサギmRNAマイクロアレイの提出が遅れているので次年度に使用しようと考えている。
Expenditure Plan for Carryover Budget	次年度にウサギmRNAマイクロアレイを提出予定である。コントロール群3検体×萎縮群3検体×回復群3検体の比較を筋層、粘膜について、計18検体提出予定である。従って、約1,000,000円の次年度使用額が発生する見込みである。