加齢黄斑変性におけるブルッフ膜修復過程の解明～Gタンパクの役割～

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K10874
• Research Institution: Nagoya City University
• Principal Investigator: 加藤 亜紀 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (60405157)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 安川 力 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (00324632)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: スフェロイド / Ｇタンパク質

Outline of Annual Research Achievements

1.ヒト網膜色素上皮(RPE)の培養およびスフェロイド作製：販売目的で海外の研究所において人眼から分離・培養し、国内のメーカーが輸入した網膜色素上皮細胞を継代培養下。加齢眼由来のリポフスチンの影響を排除するため4代以上継代した細胞を維持した。培地は一般的に上皮細胞の増殖に用いられる培地を用いて、血清及び抗菌剤を除いては増殖因子や分化誘導因子などは添加しなかったが、培養が可能であった。培養した網膜色素上皮細胞を採取し培地にメチルセルロースを添加し、98ウェルラウンドボトムプレートに6750 cell /wellの網膜色素上皮細胞を撒きスフェロイドを作製した。
2．RPEスフェロイドにおけるGタンパク発現の検討：RPEスフェロイド作製後、数時間（24時間まで）ごと、その後1日ごとにスフェロイドを採取し、cDNAを採取した。
3. RPEスフェロイドにおけるブルッフ膜様膜構造の生成過程の検討：RPEスフェロイド作製後、1日ごとでスフェロイドを経時的に採取し免疫染色でアクチンの発現状態を観察した。
4. タイムラプス撮影タイムラプス撮影が可能な顕微鏡下で培養を行い、RPEをプレートに蒔いてから、スフェロイドができるまでの過程を連続的に撮影し、経時変化を検討した。
5. Rhoキナーゼ阻害薬の検討：RPEスフェロイドを作製する際に種々の濃度のRhoキナ－ゼ阻害薬を培地に添加して、経時的にスフェロイドの直径を測定し、スフェロイドの生成過程を検討した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

RPEスフェロイド作製後、数時間（24時間まで）ごと、その後1日ごとにスフェロイドを採取し、Gタンパク（RhoA, Rac, Cdc42）の発現をRNAレベル、タンパク質レベルで経時的に測定する予定であったが、スフェロイドが安定する3日以内のサンプルを的確にさいしゅすることが困難であるため、早期のサンプルでのELISAやPCRでの評価が遅れている
また、研究室の構成員の変更により、電子顕微鏡のサンプルを扱える人が不足しており、電子顕微鏡による検討が遅れている。

Strategy for Future Research Activity

RPEスフェロイドにおけるGタンパク発現の検討：形態が安定していなくても検討可能な手法（PCR, ELISA）でスフェロイドにおけるGタンパク（RhoA, Rac, Cdc42）の発現を測定する。
Gタンパク発現抑制：継代培養中の網膜色素上皮細胞において、RPEスフェロイドを作製する直前におのおののGタンパク質（RhoA, Rac, Cdc42）のsiRNAの導入を行い、siRNA導入網膜色素上皮細胞を用いたスフェロイド作製を行う。
Gタンパク発現の検討：siRNA導入RPEスフェロイドを経時的に採取し、Gタンパクの発現をReal time RCR、ELISAおよびウェスタンブロットで評価する。
RPEスフェロイドにおけるブルッフ膜様膜構造の生成過程の検討：電子顕微鏡による観察が困難であった場合には、タイムラプス撮影や、蛍光顕微鏡での検討で評価をする。

Causes of Carryover

消耗品などの価格で端数が生じたため、8874円の差額が生じた

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度で調整する