in age related macular degeneration

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15K10874
• Research Institution: Nagoya City University
• Principal Investigator: 加藤 亜紀 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 講師 (60405157)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 安川 力 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 准教授 (00324632)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 網膜色素上皮 / スフェロイド / Ｇプロテイン

Outline of Annual Research Achievements

1.ヒト網膜色素上皮(RPE)の培養およびスフェロイド作製：販売目的で海外の研究所において人眼から分離・培養し、国内のメーカーが輸入した網膜色素上皮細胞を継代培養した。加齢眼由来のリポフスチンの影響を排除するため4代以上継代した細胞を維持した。培地は一般的に上皮細胞の増殖に用いられる培地を用いて、血清及び抗菌剤を除いては増殖因子や分化誘導因子などは添加しなかったが、培養が可能であった。培養した網膜色素上皮細胞を採取し培地にメチルセルロースを添加し、98ウェルラウンドボトムプレートに6750 cell /wellの網膜色素上皮細胞を撒きスフェロイドを作製した。
2．RPEスフェロイドにおけるGタンパク発現の検討：RPEスフェロイド作製後、数時間（24時間まで）ごと、その後1日ごとにスフェロイドを採取し、cDNAを採取した。
3. RPEスフェロイドにおけるブルッフ膜様膜構造の生成過程の検討：RPEスフェロイド作製後、1日ごとでスフェロイドを経時的に採取し免疫染色でアクチンの発現状態を観察した。
4. タイムラプス撮影タイムラプス撮影が可能な顕微鏡下で培養を行い、RPEをプレートに蒔いてから、スフェロイドができるまでの過程を連続的に撮影し、経時変化を検討した。
5. Rhoキナーゼ阻害薬の検討：RPEスフェロイドを作製する際に種々の濃度のRhoキナ－ゼ阻害薬を培地に添加して、タイムラプス撮影を行い、スフェロイドの生成過程を検討、スフェロイドの直径を評価した。さらにRhoキナーゼ阻害薬添加後の各タンパク質の発現を各タイムポイントで評価した。