2015 Fiscal Year Research-status Report
細胞間ミトコンドリア輸送因子RhoT1の歯周組織修復に対する機能解析
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15K11028
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| Research Institution | Matsumoto Dental University |
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Principal Investigator |
二宮 禎 松本歯科大学, 総合歯科医学研究所, 講師 (00360222)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小出 雅則 松本歯科大学, 総合歯科医学研究所, 講師 (10367617)
中村 浩彰 松本歯科大学, 歯学部, 教授 (50227930)
平賀 徹 松本歯科大学, 歯学部, 准教授 (70322170)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 歯学 / 細胞・組織 / 間葉系幹細胞 / ミトコンドリア輸送 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、歯周病による歯の喪失を防ぐため、間葉系幹細胞(MSCs)の細胞間ミトコンドリア(Mt)輸送能に基づき、歯周病の治療法を開発することを最終目的としている。平成27年度は、MSCsにおける細胞間Mt輸送を調節する因子として考えられているRhoT1の機能的役割を検討した。本実験は、C57BL6マウスの歯周組織を対象とした。免疫組織化学的解析により、歯周組織におけるRhoT1の局在を検索した結果、歯根膜において、RhoT1陽性細胞が点在することが認められた。RhoT1はMSCsに発現することが知られていることから、歯根膜MSCsのマーカーであるCD146の抗体を用いて、Magnetic cell sorting によりCD146陽性細胞である歯根膜MSCsを単離した。このCD146陽性歯根膜MSCsは、RhoT1を発現していた。また、この歯根膜MSCsとRAW264.7細胞の共存培養を行い、MSCsの突起におけるRhoT1の局在を観察した。MSCsの突起は、RAW264.7細胞に向かって伸びており、その突起内にミトコンドリアの存在が認められた。歯根膜におけるMSCsの役割を検討するために、ミトコンドリアをMitoTrackerによりラベルしたMSCsをLPSで処理を行った歯根膜細胞と共存培養すると、歯根膜細胞内においてMitoTrackerでラベルされたミトコンドリアの存在が確認された。これらの所見は、歯根膜MSCsが、破骨細胞や歯根膜線維芽細胞に対して、Mtを供給している可能性が示された。以上より、マウス歯根膜において、MSCsは破骨細胞や歯根膜線維芽細胞を支持することが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
歯根膜線維芽細胞に対するミトコンドリア輸送をタイムラプスにより観察する予定であったが、共焦点レーザー顕微鏡の故障により、実験が滞ってしまった。現在、染色色素を変えて対応しているが、装置の修理および条件検討により、若干、予定よりも遅れている。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成28年度は、平成27年度から継続して、「歯周組織細胞の損傷におけるRhoT1のMt輸送調節機能」に加え、「MSCsが感知する損傷細胞からのシグナル」を解明するため、以下の実験を実施する。
1. MSCsのMt輸送：歯根膜MSCsと歯根膜線維芽細胞または単球マクロファージを共存培養し、MSCsからのMt輸送をタイムラプスで観察する。
2. RhoT1によるMt輸送機能調節：RhoT1発現を改変したMSCsまたは単球マクロファージを用いて、RhoT1の機能的な役割を評価する。さらに、細胞癒合因子DC-StampとOC-Stamp発現を測定し、RhoT-1と細胞癒合の関係を検討する。本実験により、破骨細胞におけるRhoT1の機能を解明する。
3. MSCsが感知する損傷細胞からのシグナルの解明：(1) MSCsによる損傷細胞認識：培養皿を三分割(A, B, C)し、A: RhoT1改変MSCs, B: LPS処理線維芽細胞, C:LPS非処理線維芽細胞を播種し、MSCsの細胞移動、Mt輸送およびTNT形成をタイムラプスで観察する。本実験において、MSCsによる細胞認識の特異性を確認する。(2) MSCsが認識する液性因子の可能性：AにRhoT1改変MSCsを播種した後、LPS処理線維芽細胞および非処理線維芽細胞の培養上清をそれぞれ、B, Cのエリアに滴下する。MSCsの細胞移動、TNT形成、Mt輸送をタイムラプスにより継時的に観察する。(3) LPS刺激による分泌因子の検索：LPS処理細胞および非処理細胞を用いて、DNAマイクロアレイを行い、クラスター解析により損傷細胞がMSCsに伝達する因子を同定する。同定されたタンパクを歯根膜線維芽細胞に過剰発現させ、MSCsの細胞移動、TNT形成、Mt輸送をタイムラプスにより観察する。以上の実験により、細胞間Mt輸送システムの機序を解明する。
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| Causes of Carryover |
平成27年度に購入した消耗品が、予定額よりも安価に購入できたものがあったため、次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成28年度の研究に必要となる培養関連の消耗品に用いる予定である。
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