2016 Fiscal Year Research-status Report

Development of the tendon/ligament regenerative therapy utilizing human multipotent periodontal ligament stem cells

Research Project

Project/Area Number	15K11234
Research Institution	Hokkaido University
Principal Investigator	大久保直登北海道大学, 薬学研究院, 特任助教 (00553207)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	北川善政北海道大学, 歯学研究科, 教授 (00224957)
Project Period (FY)	2015-04-01 – 2018-03-31
Keywords	組織再生 / 歯根膜幹細胞 / 三次元培養 / 靭帯・腱
Outline of Annual Research Achievements	3年計画の2年目となる今年度(平成28年度)におけるテーマは、前年度に引き続き、1.『靭帯への分化に適した歯周靭帯幹細胞画分の抽出・濃縮方法の確立』であり、これは申請書の段階より『平成27～28年度』の2か年計画で行う予定としているものである。 2年目の成果として、cell sorting(細胞分取)を行うことなく、組織採取直後からの培養条件を工夫することにより、より幹細胞性の高い画分を選択的に増殖させることが出来る可能性を示すことが出来た。この結果をもとに更なる条件検討を行ったところ、前段階試験よりもより歯根膜幹細胞選別に適した培養条件を見出すことに成功した。加えて、非常に数が少なく貴重である初代培養の細胞を非常に有効に利用でき且つ、幹細胞が増殖するのに有利でさらに一度に複数の培養条件を検討できる方法の確立と、その結果を簡易的かつ定量的に数値化できる評価方法の確立にも成功した。これらの成果により、良質な歯周靭帯幹細胞の抽出方法が明らかとなったため、最適化した条件で抽出した幹細胞を用いて、in vitroにおける3次元的な靭帯構造の作成を試みた。結果として、前年度に用いた細胞と同様にヘマトキシリン・エオジン染色において、細胞の塊で形成された均一な棒状構造ではなく、外周を一層細胞でコートされ、内面は極性を有した長軸方向に平行に複数の微細な線上の構造が走るのが確認された。その線上構造は、膠原線維を染色するアザン染色によって強陽性を有する膠原繊維であることが判明した。この組織構造は、正常なヒトの靭帯の組織切片像と比較し、形態・性状ともに非常に酷似していた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 1.『靭帯への分化に適した歯周靭帯幹細胞画分の抽出・濃縮方法の確立』において、良質な歯根膜幹細胞の抽出方法を確立した。また、歯周靭帯幹細胞を用いたin vitroにおける3次元的な靭帯構造の解析については、パラフィン切片をもちいた詳細な組織的構造解析により、新たに抽出した良質な歯根膜幹細胞より三次元培養により作成した靭帯様構造は正常なヒトの靭帯組織像と比較して、従来の幹細胞を用いるよりもより、形態・性状ともに非常に酷似していることが判明した。手動の引っ張り試験においても強靭な構造が形成されていることも判明した。しかし、定量性を持たせるために引っ張り試験用の機器を利用した引張り試験を行う予定だったが、設備の関係でまだ行うことができておらず、機能的な靭帯としての質を判定することができていない。
Strategy for Future Research Activity	3年計画の2年目となる今年度(平成28年度)におけるテーマは、前年度に引き続き1.『靭帯への分化に適した歯周靭帯幹細胞画分の抽出・濃縮方法の確立』であったが、培養条件の検討により従来法と比較して複数の幹細胞マーカーの発現やコロニー形成能がにおいて優れた幹細胞性を有する歯根膜幹細胞を抽出することに成功した。今後の予定として、良質でかつ個人差を伴わず再現性良く幹細胞画分を選別できる培養条件の検討とともに、靭帯作成に適した幹細胞の選別法の検討を、転写因子『Screlaxis(Scx)』や『Tenomodulin(Tnmd)』などを指標により詳細に検討を行う予定である。三次元培養における靭帯構造形成方法については、工学系の機器などを利用することで定量的な引っ張り試験を行えるように調整中であるが、まだ難航しているため、靭帯の機能的な評価が完了していない。これが首尾よく進み定量的に靭帯の強度を評価することが出来れば、靭帯作成に適した歯根膜幹細胞を作成する指標となるため、この評価系を確立されることが急務となる。機能的な評価が完了した後、動物への移植実験によりより実践的な評価を行う予定としている。