Elucidation of matrix vesicles secretion mechanism and application to calcification

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15K11368
• Research Institution: The University of Tokushima
• Principal Investigator: 上田 公子 (山口公子) 徳島大学, 病院, 助教 (40335807)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 岩本 勉 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学系), 教授 (90346916) ; 長谷川 智一 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学系), 講師 (50274668) ; 北村 尚正 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学系), 助教 (50614020)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 基質小胞 / 歯原生上皮細胞

Outline of Annual Research Achievements

象牙芽細胞やエナメル芽細胞は、それぞれ象牙質、エナメル質の形成を担う細胞であるが、これらの細胞がどのように硬組織を形成していくのか詳細な分子機構については不明な点も多い。これらの細胞はそれぞれ硬組織形成の基盤になる基質蛋白質の合成を担っているが、それだけでは石灰化は起きない。それらと同時に分泌される様々な酵素や生理活性物質を含む脂質二重膜で囲まれた基質小胞が石灰化部位の決定と初期石灰化に重要な役割を担っている。本研究では基質小胞の分泌メカニズムの解明とその応用方法の開発を目指した。
前年度までの結果、歯原性間葉細胞株mDPの培養上清からは、CD9とCD81の発現は確認できなかったが、歯原性上皮細胞株SF2の培養上清においてCD9のわずかな発現を認めた。この実験では、ウシ胎児血清(FBS)由来の基質小胞の混入をさけるため、超遠心して基質小胞を除去したFBSを使用した。超遠心したFBS上清は３分画に分かれる。これまでに、マウスの歯胚では分化の過程でCD9の発現の消失が確認されている。
このため、各層が細胞の増殖や分化にどのように影響し、どの層が基質小胞回収に有利かどうか先に確認することとし、今年度の研究を開始した。超遠心したFBSから回収した３つの層をそれぞれ含む培地にてSF2の培養を行い、増殖試験（細胞カウント・BrdU）と分化（Amelogenin・Ameloblastin）についての実験を行った。結果、第３層が細胞増殖を著明に促進する所見を得た。そこで、第３層を用いて、SF2の細胞培養上清から、基質小胞の分離、回収を目指した。しかし、今回試みた細胞培養条件では、十分な量の基質小胞の回収には至らなかった。第３層の次に増殖能のある第２層を用いても結果は同じであった。
これらの結果より、歯原性間葉細胞より歯原性上皮細胞の方が基質小胞発現により関与している可能性が示唆された。