2016 Fiscal Year Research-status Report
低分子メタボロームの質量分析による歯周病と全身疾患の相互連関メカニズムの解明
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15K11386
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
野崎 剛徳 大阪大学, 歯学研究科, 助教 (30263304)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
豊田 岐聡 大阪大学, 理学研究科, 教授 (80283828)
馬場 健史 九州大学, 生体防御医学研究所, 教授 (10432444)
柳田 学 大阪大学, 歯学部附属病院, 講師 (80379081)
北垣 次郎太 大阪大学, 歯学部附属病院, 助教 (90570292)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 歯周病 / 質量分析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1. 肥満モデル動物および歯周病モデル動物の作製と歯周病原性細菌の経口接種：５週齢のC57BL/6マウスに高脂肪食の給餌を４ヶ月間行うことで、肥満モデルマウスを作製した。この間、グルコース負荷試験、インスリン負荷試験を経時的に行い、マウスの全身状態を確認した。またC57BL/6マウスの上顎第二臼歯に8-0絹糸を結紮することで、実験的に歯周炎を惹起させた歯周病モデルマウスを作製した。そしてこれらのマウスの外側尾静脈から末梢血を採取した。またこれらのマウスにP.gingivalisを経口接種し、同様に末梢血を採取した。
2. 検体前処理と前処理法の改良：平成28年度はメタボロームの解析に加えて、リピドームの解析法の開発を行った。各検体に抽出溶媒を添加して振盪した後、16,000×gで遠心して上層（水層）と下層（クロロホルム相）を分離し、それぞれの層の溶液を回収した。この下層の溶液からクロロホルムを気化蒸散させた後に、一定量の内部標準物質を添加して、超臨界流体抽出／超臨界流体クロマトグラフシステム（Nexera UC, Shimadzu Co.）にて超臨界流体クロマトグラフィー（SFC）分析を行い、さらにそのカラム溶出液をハイブリッド四重極-オービトラップ質量分析計(Q-exactive, Thermo Fisher Scientific, Inc.)にて分析した。
3. 質量分析計を用いたリピドームの検出：上記の方法でリピドーム解析を行った結果、高脂肪食を給餌した肥満モデルマウスでは、通常食を給餌したマウスに比べて血清中のスフィンゴミエリン量が約1.4倍に増加（p < 0.05）する反面、リゾホスファチジルエタノールアミン量が約60%に減少（p < 0.05）することが明らかになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成28年度に実施を予定した各項目のうち、肥満モデル動物および糖尿病モデル動物への歯周病原性細菌の経口接種と実験的歯周炎の惹起、検体前処理と前処理法の改良、質量分析計を用いた低分子メタボロームの検出、肥満モデル動物におけるメタボローム変動の解析は、概ね順調に進展した。
現在は、歯周病原性細菌の経口接種モデル動物や実験的歯周炎の惹起におけるメタボライトの変化の解析を進めており、この結果を受けて、H29年度には予定どおり、病態の異なる歯周炎が発生するモデル動物における歯周病原性細菌の経口接種および実験的歯周炎の惹起によるメタボローム変動の比較解析や、歯周病と全身疾患の相互影響に関するメタボロミクス相関解析を実施する予定としている。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成29年度の研究実施計画
1. 病態の異なる歯周炎が発生するモデル動物（PLAP-1ノックアウトマウス）への肥満病態の誘導と、実験的歯周炎の惹起：野生型C57BL/6マウス、ならびに歯周炎を惹起した際の骨吸収が少ないという特徴を有するPLAP-1ノックアウトマウスを用いて、肥満モデルマウスを作製する。これらのマウスにP.gingivalis を経口接種するとともに、上顎第二臼歯に絹糸を結紮して実験的歯周炎を惹起させ、末梢血を採取する。採取した検体は-80℃で凍結保存する。
2. 検体の前処理と質量分析計を用いた低分子メタボロームおよびリピドームの検出：平成27年度・平成28年度の研究で開発した方法で検体の前処理を行い、上層ならびに下層の溶液をともに回収して、-80℃で凍結保存する。そして上層を用いてGC/MSによる低分子メタボロームの検出を、また下層を用いてSFC/ MSによるリピドームの検出を行う。
3. 歯周病と全身疾患の相互影響に関するメタボロミクス相関解析：GC/MSならびにSFC/MSのデータを基に相関解析を行い、歯周病と肥満の相互連関に関与する分子の同定を行う。さらに、これらの分析によって得られた結果をもとに、歯周病と全身疾患の相互影響に関与する分子を探索し、歯周病-全身疾患の相互連関メカニズムを解明する。
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| Causes of Carryover |
現在進行中の研究に用いる物品で、使用期限等の関係から購入時期を検討している物品があるため、次年度使用額が生じている。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
現在使用中の物品が無くなりしだい、物品の購入を行う予定としており、使用計画に変更はない。
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[Journal Article] Metabolomic Analysis of Gingival Crevicular Fluid Using Gas Chromatography/Mass Spectrometry2016
Author(s)
Ozeki, M., Nozaki, T., Aoki, J., Bamba, T., Jensen, K.R., Murakami, S., Toyoda, M
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Journal Title
Mass Spectrometry
Volume: 5
Pages: 1-6
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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