膜タンパク質複合体のS-SAD法による構造解析

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K14468
• Research Institution: High Energy Accelerator Research Organization
• Principal Investigator: 加藤 龍一 大学共同利用機関法人高エネルギー加速器研究機構, 物質構造科学研究所, 准教授 (50240833)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: POMT1 / POMT2 / ジストログリカン / 筋ジストロフィー / 膜タンパク質 / 結晶構造解析

Outline of Annual Research Achievements

先天性筋ジストロフィー症は、細胞外基質の構成タンパク質であるα-ジストログリカンの糖鎖修飾異常がその原因である。α-ジストログリカン上の糖鎖を介して、ラミニン（laminin）などに代表される細胞外基底膜に存在するタンパク質群と相互作用をする。すなわち、α-ジストログリカンの糖鎖修飾異常により、α-ジストログリカンと細胞外基底膜に存在するタンパク質群との相互作用が破綻する結果、筋繊維細胞などが異常を起こし、先天性筋ジストロフィー症を発症する。
このα-ジストログリカンの糖鎖の最初のマンノースを付加する酵素としてPOMT1-POMT2が同定されたが、膜タンパク質複合体はであることの困難さからその立体構造は決定されていない。このPOMT1-POMT2複合体の立体構造解析を進めるために、哺乳類細胞を用いてその発現系を確立し、界面活性剤や脂質の検討を行い、POMT1-POMT2複合体の結晶化が可能になる精製法の確立を目指して研究を進めている。POMT1-POMT2複合体の精製に成功すれば、その結晶化を行い、硫黄原子の異常分散効果を利用する位相決定法（S-SAD法）を用いて立体構造解析を行う予定である。
本年度は、POMT1, POMT2 それぞれについて発現コンストラクトの設計を行い、それに基づいて発現用プラスミドの作成を行った。また、GFP融合タンパク質の発現を確認するための蛍光プレートリーダーの測定条件の検討、LCP法による結晶化方法についての検討を開始した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

POMT1, POMT2 の発現コンストラクトの設計を行い、それに基づいて発現用プラスミドの作成を行った。理由は不明だが、POMT2については発現コンストラクトの作成が著しく困難で、得られた形質転換体の制限酵素切断パターン、DNA配列解析を行って目的のものが得られていないことが分かるということが数回繰り返された。そのため、研究計画が遅れ、今年度予定していた培養細胞への導入まで行うことはできなかった。一方、GFP融合タンパク質の発現を確認するための蛍光プレートリーダーの測定条件の検討、LCP法による結晶化方法についての検討を開始した。

Strategy for Future Research Activity

培養細胞へのトランスフェクションには比較的多くのDNAを必要とするので、発現コンストラクトで必要なDNA量が得られるものを選定し、それについて研究を進める。それが困難な場合には、発現コンストラクトの見直しを行う。
GFP融合タンパク質として高発現を示したものを選定し、それについて、タグや融合タンパク質部の切り離しを行う。得られたサンプルがどのような界面活性剤や脂質存在下で安定であるかを測定し、その最適化を行う。
安定なサンプルが一定量以上得られる条件が見出されれば、結晶化スクリーニングを行い、結晶が得られれば放射光Ｘ線を照射して回折能の測定、回折データセットの収集、構造解析と進めていく。

Causes of Carryover

発現プラスミド作成に予想外に時間がかかり、本来予定していた培養細胞へのインフェクション実験を行うことができなかった。そのため、高価なインフェクション試薬等の購入をしなかったので次年度使用額が生じた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

インフェクションに必要な大量のDNA調整およびトランスフェクションを実施する予定で、それに必要な研究経費として執行する予定である。