膜脂質の疎水性部分を可視化する逆転凍結レプリカ法の開発

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K14506
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 藤本 豊士 名古屋大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (50115929)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 辻 琢磨 名古屋大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (40725628)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 膜脂質 / 電子顕微鏡

Outline of Annual Research Achievements

数千種類にのぼる生体膜脂質の分布を可視化する方法として、我々は急速凍結・凍結割断レプリカ(QF-FRL)法を確立し、GM1, PI(4,5)P2, PI3Pなどについて結果を報告してきた。しかしながらQF-FRLが識別するのは糖鎖、イノシトール環など、膜脂質の親水性頭部の違いであり、膜脂質の多様性のもう一つの要因である疎水性尾部の違いを明らかにすることは原理的に困難であった。今回の研究では生体膜分子の二次元的分布を物理的に固定し、安定に保持するという凍結割断レプリカ法の利点を活用し、コレステロールや疎水性尾部の違いを可視化する方法、すなわち従来のQF-FRL法とは逆に親水性頭部に蒸着を行って物理的に固定し、疎水性部分を標識するという方法を開発する。また露出された疎水性部分は水溶液中では本来の構造を維持できず、標識分子との結合が起こらない可能性があるため、有機溶媒を含む環境でも特異的な結合が可能なクリック反応を応用する。本年度は親水性頭部に蒸着を行うための急速凍結法などの条件検討を行い、構造保持については問題がないことを確認した。一方、クリック反応に必要なアルキン基を持つ脂質アナログの開発に着手し、一部については合成を終え、さらにそのアナログが本来の内在性脂質と同様の性質を持つことを確認した。次年度は脂質アナログを予め取り込ませた細胞を材料として、レプリカを作製し、標識、電顕観察を行う予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

形態学的方法、脂質アナログ合成と性質の確認の両方について予定していた検討を行うことができた。

Strategy for Future Research Activity

脂質アナログを取り込ませた細胞を新たな標識法で標識、観察し、結果を吟味して方法の確立を進める。

Causes of Carryover

クリック反応に必要なアルキン基を持つ脂質アナログの一部についての合成を終え、性質を確認したが、レプリカ標識に応用する実験には着手できなかったため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

早急にレプリカ標識の実験を開始する予定である。