2015 Fiscal Year Research-status Report
自発ブリンキング能を持つ蛍光色素を用いた内在性タンパク質の細胞内１分子動態計測
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15K14516
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
神原 丈敏 国立研究開発法人理化学研究所, 生命システム研究センター, 研究員 (40451637)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | １分子動態計測 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、ゲノム編集技術を用いた内在性タンパク質への蛍光タグ導入と、自発ブリンキング能を持つ蛍光色素を利用したストロボスコピー計測を組み合わせることで、細胞質を自由拡散する内在性タンパク質分子の１分子動態計測の実現を目指している。
本年度では、まずゲノム編集を用いた内在性タンパク質の標識法の確立を試みた。これまでに広く利用されているゲノム編集技術では修復の際のエラーが多いために遺伝子ノックインには適さない。そこで、改良型TALENであるSuperTALENを用いて、homology independent repairを利用することで高効率に目的タンパク質遺伝子のC末部分に蛍光標識を導入することを行った。複数の種類の培養細胞において、非常に高効率でキネシンのC末にGFPをノックインすることができ、培養細胞での高効率ノックイン手法の確立に成功した。同様に、自発ブリンキング能を持つ蛍光色素で内在性キネシンを標識するためにHalo-tagのノックインもおこなった。
また、最適なブリンキング能を持つ蛍光色素の選択をおこなった。光褪色を防いで動態計測を行うためには、間歇露光が有効である。そこで、間歇露光を実現する新しい方法として、自発ブリンキング能を持つ新しい蛍光色素を用いる。細胞質中でのタンパク質の拡散速度から、明状態の持続時間が数ミリ秒、暗状態の持続時間がその10～100倍が適していると予想される。そこで、すでに作成済みの化合物の中から、この条件を満たす色素を選抜した。今後は、これをもちいてGFP標識キネシンを標識して観察条件の最適化を行い、１分子動態計測を行う。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
培養細胞での高効率ノックイン手法を確立でき、従来法よりも短時間での作製が可能になった。研究実施計画にあげた多くの項目が本年度中に達成でき、成果が得られている。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度は当初の予定通り、自発的にブリンキングする蛍光色素の観察条件の最適化を行い、細胞質を自由拡散する内在性タンパク質の１分子動態計測へと進む予定である。
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| Causes of Carryover |
価格改定のため、端数が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
少額なので、特に計画の変更はない。
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