2016 Fiscal Year Annual Research Report
Single molecule imaging of endogenous protein in living cells using spontaneously blinking fluorophore
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15K14516
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
神原 丈敏 国立研究開発法人理化学研究所, 生命システム研究センター, 研究員 (40451637)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | １分子動態計測 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、ゲノム編集技術を用いた内在性タンパク質への蛍光タグ導入と、自発ブリンキング能を持つ蛍光色素を利用したストロボスコピー計測を組み合わせることで、細胞質を自由拡散する内在性タンパク質分子の1分子動態計測を目指す。
今年度は、前年度で確立した改良型TALENであるSuper TALENによる高効率で目的タンパク質遺伝子のC末部分に蛍光標識を導入する技術を用いて、キネシンのC末にGFPをノックインし、内在性キネシンの細胞内での運動特性の定量的な計測及び解析をするための方法論の検証を行った。その過程で、細胞の全領域で自由拡散するタンパク質１分子を観察して１細胞内での反応速度定数の空間分布を求めることができ、尚且つ、GFPと自発ブリンキング蛍光色素との同時計測を可能にする顕微鏡システムの開発が必要になり、この開発を行った。
本手法では自発ブリンキングすなわち蛍光分子の確率的な明滅を利用するため、特に視野中の分子数が少ない時には閉環体寿命の揺らぎにより測定値が大きく変動する。従って、精度よく分子数を推定するために、最適なフレームレート設定と計測結果から分子数を推定するためのアルゴリズムの開発が必要になる。そこで、GFP標識キネシンを用いることで、我々が独自に開発した高速１分子顕微鏡によるGFP濃度計測の結果と、自発ブリンキングを利用した計測結果の比較を行い、検証を行った。動態計測へ応用するためには、通常、分子数の計測の際には標的タンパク質をできるだけ１００％近い効率で標識する必要があるが、逆に標識時に用いる色素の量を減らすことで意図的に標識率を下げ、視野中に標識されたタンパク質が数個しか存在しない条件で、観察条件の最適化を行った。
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