2015 Fiscal Year Research-status Report
ゲノム編集技術を応用した特定ゲノム部位に対するDNAメチル化導入手法の確立
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15K14924
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| Research Institution | Kitasato University |
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Principal Investigator |
山崎 大賀 北里大学, 北里大学メディカルセンター, 上級研究員 (90524231)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | エピゲノム編集 / DNAメチル化 / セントロメア |
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| Outline of Annual Research Achievements |
DNAメチル化は転写制御を担うゲノム修飾であり、細胞の発生・分化のみならず、癌化など様々な疾患にも関与している。ゲノム上の特定の位置に対するDNAメチル化の人為的操作が可能となれば、基礎面・応用面で大きな価値が存在するが、確立された手法は存在しないのが現状である。そこで、本研究はゲノム編集技術を応用した「エピゲノム編集」の技術開発を行い、DNAメチル化導入に焦点を置いた実験手法の確立を目指す。ゲノム編集で用いられるDNA認識モジュールとDNAメチル化酵素モジュールを融合させた人工酵素によって①セントロメア・サブテロメア②レトロトランスポゾン③シングルコピー遺伝子の3種類について配列特異的なDNAメチル化導入方法の確立を目指す。まず本年は実験系の構築とペリセントロメア領域へのDNAメチル化導入について検討を行った。
ペリセントロメアDNAが低メチル化状態を示すマウス卵子をモデル細胞として、マウスペリセントロメア（Major satellite）を認識するTALEのC末端側にDNAメチル化酵素（SssI）を配置した人工タンパク質(TALMaj-SssI)を構築し、卵子内で発現させた。DNAメチル化検出プローブ、セントロメア検出プローブによる細胞核内イメージングおよびバイサルファイトシーケンスの結果から、ペリセントロメア優先的にDNAメチル化の強制導入を行うことができたという実験確証を得た。同様にCRSPR/Cas9の系を応用し、dCas9-SssIとMajor satelliteに設計したガイドRNAを発現させた場合においてもペリセントロメア優先的なDNAメチル化導入が認められた。しかし、標的配列以外の非特異的領域へのDNAメチル化導入もTALEよりも多く認められたため、dCas9を用いる系ではより厳密な制御が必要であることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
DNAメチル化導入に用いる人工酵素の発現系構築に費やす時間が多くなったが、まずはペリセントロメアへのDNAメチル化導入について実験を行い、DNAメチル化の強制導入が可能であるとの実験確証を得ることができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
標的配列へのDNAメチル化導入についてはCRISPRよりもTALEを用いた方が特異性が高くなるという結果を得たが、人工酵素の発現量の調節やガイドRNAの設計、人工酵素とgRNAの発現比調節など細かい条件設定は改善する余地が残っている。次年度の課題に挙げているレトロトランスポゾンおよびシングルコピー遺伝子へのDNAメチル化導入を行う際にこの課題について検討を行う。CRISPRの実験系においてはDNAメチル化酵素の活性制御を行うためのアミノ酸変異体を用いることや、酵素の2分割法などを試みるべく、実験系の改善についても検討を行う。
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| Causes of Carryover |
DNAメチル化操作した細胞の詳細な生化学的な解析を行う事が出来なかったためめ、このための予算が次年度使用額となった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
DNAメチル化操作した細胞における細胞特性の変化の解析に当該予算を充足する。
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