2016 Fiscal Year Research-status Report
ゲノム編集技術を応用した特定ゲノム部位に対するDNAメチル化導入手法の確立
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15K14924
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| Research Institution | Kitasato University |
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Principal Investigator |
山崎 大賀 北里大学, 北里大学メディカルセンター, 上級研究員 (90524231)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | DNAメチル化 / エピゲノム編集 / ペリセントロメア |
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| Outline of Annual Research Achievements |
DNAメチル化は転写制御を担うゲノム修飾であり、細胞の発生・分化のみならず、癌化など様々な疾患にも関与している。ゲノム上の特定の位置に対するDNAメチル化の人為的操作が可能となれば、基礎面・応用面で大きな価値が存在するが、確立された手法は存在しないのが現状である。そこで、本研究はゲノム編集技術を応用した「エピゲノム編集」の技術開発を行い、DNAメチル化導入に焦点を置いた実験手法の確立を目指すことを目的とした。
これまでマウスペリセントロメアのMajor satelliteに対して結合するTALEN (TALMaj)と細菌由来のCpGメチル化酵素SssIとの融合遺伝子（TALMaj-SssI）を細胞内で発現させることによってマウス卵子およびマウスES細胞内において標的配列に対してDNAメチル化導入が可能なことを示した。同様の結果が不活性型Cas9（dCas9）とSssIとの融合タンパク質（dCas9-SssI）をガイドRNAと一緒に細胞内で発現させることによっても得られたが、オフターゲット効果をTALENおよびCRISPRで比較した場合、融合遺伝子にSssIを用いた本システムではCRISPRよりもTALENの方が高い特異性を有するという結果が得られた。
更に着床前初期胚発生において、分裂期の染色体異常をペリセントロメアへのDNAメチル化導入胚とDNAメチル化非導入胚で比較したところ、両者に統計学的な差は認められなかった。以上から、ペリセントロメアDNAのメチル化は着床前初期胚のキネトコア機能に影響しない可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ペリセントロメアへのDNAメチル化導入については雑誌論文への投稿を行い、現在リビジョン中である。今後は開発した手法を応用し、ペリセントロメアのDNAメチル化がどのような細胞生物学的機能に寄与するのか検討を行う。
SssI自身は非常に強力なDNAメチル化活性を有するために、本酵素を安定的に発現する細胞株を樹立することが難しい。オフターゲット少なく効率的に標的へのDNAメチル化導入行うためには使用する細胞と発現プロモーターとの組み合わせによる酵素の至適発現量の検討や、酵素活性を弱めるようなSssIのアミノ酸変異体の使用が有効だと考えられる。現在まで発現プロモーターの検討およびSssIのアミノ酸変異体を用いた改良版のTALMaj-SssIの開発を行っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
開発した酵素（TALMaj-SssI）をDNAメチル化酵素欠損マウスES細胞（Dnmt TKO ES細胞）に導入し、ペリセントロメアのみDNAメチル化が亢進している細胞の作製を現在行っている。今後は作製した細胞とDnmt TKO ES細胞との比較解析を通じてペリセントロメアのDNAメチル化機能について検討を行っていく。
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| Causes of Carryover |
DNAメチル化導入手法については、「実験手法の開発」という内容で論文を投稿中である。査読が終了して追加実験を求められた段階で年度をまたいだ実験スケジュールとなることが判明した。追加実験の予算確保のため、次年度使用額が発生した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
クロマチン免疫沈降で使用する抗体や試薬の購入、論文掲載費用およびDNAメチル化編集を行った細胞の遺伝子発現解析に予算を充てる予定である。
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