Investigation of a physiological role of endosome-mitochondrial interaction by fluorescence bioimaging

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15K15023
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 大場 雄介 北海道大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (30333503)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 細胞内小器官 / 相互作用 / 蛍光バイオイメージング

Outline of Annual Research Achievements

昨年度までに、ミトコンドリア局在タンパク質の1つがPI3Kと結合すること、その分子をsiRNA法によりノックダウンするとRas-PI3K複合体のエンドソーム局在とエンドサイトーシスが抑制されることを見出した。また、この分子には哺乳動物において3つのファミリー分子があることが、免疫沈降を用いた解析によりいずれのメンバーもPI3Kと結合するものの、当該因子のみが特異的にエンドサイトーシスの制御に関与することを報告した。
本年度は当該因子の細胞内動態を解析するために、蛍光タンパク質を付加した融合タンパク質発現構築した。昨年度の実験において、蛍光タンパク質を付加したコンストラクトは、既報のあるいは我々の手で実施した免疫蛍光染色による内在性タンパク質の局在と大きく異る問題点が浮上した。そのため、蛍光タンパク質を2つの断片に分割し、11番目のβシートのみを因子と融合し、他の10個のβシートは別に発現させるスプリット蛍光タンパク質の系を用いることで、内在性タンパク質と同じ局在を示す蛍光タンパク質との融合タンパク質発現系構築に成功した。
また、ミトコンドリアとエンドソームの物理的な相互作用についても検討を行った。オルガネラマーカーを用いた両者の蛍光画像からオルガネラの位置を数値化し、その距離を測定した。それによりまず、ミトコンドリアとエンドソームはある一定の確率で共局在すること、共局在は増殖因子等の刺激により一過性に亢進することがわかった。次に上記で同定した分子をノックダウンした細胞で同様の解析を行ったところ、増殖因子刺激による共局在の亢進が見られなかった。以上より本研究で解析した因子は、ミトコンドリアとエンドソームの物理的な相互作用を誘導することで、エンドサイトーシスやエンドソームの成熟を正に制御すると考えられた。この相互作用の生理的意義を明らかにした上で本成果を論文として発表する予定である。

Research Products

• [Journal Article] Rab5-regulated endocytosis plays a crucial role in apical extrusion of transformed cells. (2017)
  • Author(s): S. Saitoh, T. Maruyama, Y. Yako, M. Kajita, Y. Fujioka, Y. Ohba, N. Kasai, N. Sugama, S. Kon, S. Ishikawa, T. Hayashi, T. Yamazaki, M. Tada and Y. Fujita.
  • Journal Title: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. Volume: 114 Pages: E2327-E2336
  • DOI: 10.1073/pnas.1602349114
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Improved FRET biosensor for the measurement of BCR-ABL activity in chronic myeloid leukemia cells. (2017)
  • Author(s): M. Horiguchi, M. Fujioka, T. Kondo, Y. Fujioka, X. Li, K. Horiuchi, A.O. Satoh, P. Nepal, S. Nishide, A. Nanbo, T. Teshima and Y. Ohba.
  • Journal Title: Cell. Struct. Funct. Volume: 42 Pages: 15-26
  • DOI: doi.org/10.1247/csf.16019
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] A leukemogenic kinase, FIP1L1-PDGFRA, and a SUMO E3 ligase, PIAS1, form a positive crosstalk via their enzymatic activities. (2017)
  • Author(s): M. Ibata, J. Iwasaki, Y. Fujioka, K. Nakagawa, S. Darmanin, M. Onozawa, D. Hashimoto, Y. Ohba, S. Hatakeyama, T. Teshima and T. Kondo.
  • Journal Title: Cancer Sci. Volume: 108 Pages: 200-207
  • DOI: 10.1111/cas.13129
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Epstein-Barr virus exploits host endocytic machinery for cell-to-cell viral transmission rather than a virological synapse. (2016)
  • Author(s): A. Nanbo, K. Kachi, H. Yoshiyama and Y. Ohba.
  • Journal Title: J. Gen. Virol. Volume: 97 Pages: 2989-3006
  • DOI: 10.1099/jgv.0.000605.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Tumour endothelial cells in high metastatic tumours promote metastasis via epigenetic dysregulation of biglycan. (2016)
  • Author(s): N. Maishi, Y. Ohba, K. Akiyama, N. Ohga, J.I. Hamada, H. Nagao-Kitamoto, M. Alam, K. Yamamoto, T. Kawamoto, N. Inoue, A. Taketomi, M. Shindoh, Y. Hida and K. Hida.
  • Journal Title: Sci. Rep. Volume: 6 Pages: 28039
  • DOI: 10.1038/srep28039
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Lypd8 promotes the segregation of flagellated microbiota and colonic epithelia. (2016)
  • Author(s): R. Okumura, T. Kurakawa, T. Nakano, H. Kayama, M. Kinoshita, D. Motooka, K. Gotoh, T. Kimura, N. Kamiyama, T. Kusu, Y. Ueda, H. Wu, H. Iijima, S. Barman, H. Osawa, H. Matsuno, J. Nishimura, Y. Ohba, S. Nakamura, T. Iida, M. Yamamoto, E. Umemoto, K. Sano and K. Takeda.
  • Journal Title: Nature Volume: 532 Pages: 117-121
  • DOI: 10.1038/nature17406
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Receptor activator of NF-κB ligand induces cell adhesion and integrin α2 expression via NF-κB in head and neck cancers. (2016)
  • Author(s): T. Yamada, M. Tsuda, T. Wagatsuma, Y. Fujioka, M. Fujioka, A.O. Satoh, K. Horiuchi, S. Nishide, A. Nanbo, Y. Totsuka, H. Haga, S. Tanaka, M. Shindoh and Y. Ohba.
  • Journal Title: Sci. Rep. Volume: 6 Pages: 23545
  • DOI: 10.1038/srep23545
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Attenuation of ligand-induced activation of angiotensin II type 1 receptor signaling by the type 2 receptor via protein kinase C. (2016)
  • Author(s): T. Inuzuka, Y. Fujioka, M. Tsuda, M. Fujioka, A.O. Satoh, K. Horiuchi, S. Nishide, A. Nanbo, S. Tanaka and Y. Ohba.
  • Journal Title: Sci. Rep. Volume: 6 Pages: 21613
  • DOI: 10.1038/srep21613
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] A role of the sphingosine-1-phosphate (S1P)-S1P receptor 2 pathway in Epithelial Defense Against Cancer (EDAC). (2016)
  • Author(s): S. Yamamoto, Y. Yako, Y. Fujioka, M. Kajita, T. Kameyama, S. Kon, S. Ishikawa, Y. Ohba, Y. Ohno, A. Kihara and Y. Fujita.
  • Journal Title: Mol. Biol. Cell Volume: 27 Pages: 491-499
  • DOI: 10.1091/mbc.E15-03-0161
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] 蛍光イメージングを用いた細胞内シグナル伝達によるエンドサイトーシスの制御機構の解析 (2017)
  • Author(s): 大場 雄介、藤岡 容一朗
  • Organizer: 第122回解剖学会
  • Place of Presentation: 長崎大学坂本キャンパス（長崎県・長崎市）
  • Year and Date: 2017-03-28 – 2017-03-30
  • Invited
• [Presentation] 蛍光イメージングで紐解くインフルエンザウイルス感染の分子基盤 (2016)
  • Author(s): 大場 雄介、藤岡 容一朗、西出 真也、南保 明日香
  • Organizer: 第54回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: つくば国際会議場(茨城県・つくば市)
  • Year and Date: 2016-11-25 – 2016-11-27
  • Invited
• [Presentation] 慢性骨髄性白血病分子標的治療薬薬効評価のためのFRETバイオセンサーの開発と改良 (2016)
  • Author(s): 大場 雄介、近藤 健、豊嶋 崇徳
  • Organizer: 第75回日本癌学会学術総会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川県・横浜市）
  • Year and Date: 2016-10-06 – 2016-10-08
• [Presentation] 生きた白血病細胞でBCR-ABL活性を精密測定するめのFRETバイオセンサーの改良 (2016)
  • Author(s): 大場 雄介、藤岡 真理、堀口 美香、近藤 健、豊嶋 崇徳
  • Organizer: 第89回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 仙台国際センター 東北大学川内北キャンパス（宮城県・仙台市）
  • Year and Date: 2016-09-25 – 2016-09-27
• [Presentation] インフルエンザウイルス粒子の取り込みを制御するシグナル伝達機構 (2016)
  • Author(s): 大場 雄介
  • Organizer: 第6回北海道探索病理学研究シンポジウム
  • Place of Presentation: ニューオータニイン札幌 （北海道・札幌市）
  • Year and Date: 2016-09-17 – 2016-09-17
  • Invited
• [Presentation] ライブセル蛍光イメージングの口腔疾患予防への応用 (2016)
  • Author(s): 西出 真也、藤岡 容一朗、堀内 浩水、堀口 美香、佐藤 絢、 Prabha Nepal、王 セイ、南保 明日香、大場 雄介
  • Organizer: 第58回歯科基礎医学会学術大会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター(北海道・札幌市）
  • Year and Date: 2016-08-24 – 2016-08-26
• [Presentation] 蛍光バイオセンサーを用いた時計タンパク質 BMAL1-CLOCK の細胞内動態の解析 (2016)
  • Author(s): 西出 真也、藤岡 容一朗、堀内 浩水、堀口 美香、佐藤 絢、Prabha Nepal、Jing Wang、南保 明日香、大場 雄介
  • Organizer: 第68回日本細胞生物学会
  • Place of Presentation: 京都テルサ(京都府・京都市）
  • Year and Date: 2016-06-15 – 2016-06-17
• [Presentation] インフルエンザウイルス宿主細胞侵入を制御する宿主側因子の同定 (2016)
  • Author(s): 藤岡 容一朗、西出 真也、佐藤 絢、堀内 浩水、Prabha Nepal、堀口 美香、Jing Wang、南保 明日香、大場 雄介
  • Organizer: 第68回日本細胞生物学会
  • Place of Presentation: 京都テルサ(京都府・京都市）
  • Year and Date: 2016-06-15 – 2016-06-17
• [Presentation] Ras-PI3K 複合体の時空間制御を介したエンドサイトーシス調節因子の探索 (2016)
  • Author(s): 堀内 浩水、藤岡 容一朗、佐藤 絢、Prabha Nepal、堀口 美香、Jing Wang、西出 真也、南保 明日香、小布施 力史、大場 雄介
  • Organizer: 第68回日本細胞生物学会
  • Place of Presentation: 京都テルサ(京都府・京都市）
  • Year and Date: 2016-06-15 – 2016-06-17
• [Presentation] Ras-PI3K シグナルを介したエンドサイトーシス制御機構におけるミトコンドリアポアタンパク質の機能解析 (2016)
  • Author(s): 佐藤 絢、藤岡 容一朗、堀内 浩水、西出 真也、Prabha Nepal、堀口 美香、Jing Wang、南保 明日香、大場 雄介
  • Organizer: 第68回日本細胞生物学会
  • Place of Presentation: 京都テルサ(京都府・京都市）
  • Year and Date: 2016-06-15 – 2016-06-17
• [Book] SH2 domain-based FRET biosensor for measuring BCR-ABL activity in living CML cells. (2017)
  • Author(s): Fujioka M, Asano Y, Nakada S and Ohba Y.
  • Total Pages: 22
  • Publisher: Springer