2016 Fiscal Year Research-status Report
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15K15405
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| Research Institution | Kanazawa Medical University |
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Principal Investigator |
八田 稔久 金沢医科大学, 医学部, 教授 (20238025)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 胎盤関門 / 胎盤絨毛 / 母胎間シグナル伝達 / DOHaD |
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| Outline of Annual Research Achievements |
母体環境に起因する胎児のエピゲノム変化を、出生後の慢性疾患の形成素因とする仮説（胎児起源仮説、DOHaD）は、病因形成の新しい概念として注目されている。我々が同定した母胎児間シグナルリレー（母体LIF-胎盤ACTH-胎児LIF）による胎児の発生調節機構(Simamura et al, 2010)は、DOHaD仮説を検証するうえで重要なモデルである。このモデルにおいて母胎間シグナルの伝達を効率よく行うための組織構築が胎盤に存在することが予想されていた。本研究課題では、我々が開発してきた超広視野、高倍率観察が可能な共焦点レーザー顕微鏡ベースの画像取得装置を用いて、胎盤絨毛間腔（母体側）と絨毛血管（胎児側）をダイレクトに架橋する情報伝達装置の存在を証明する。平成28年度には、以下の内容について検討を行った。（１）深部観察を可能とする胎盤組織の透明化プロトコルの検討を行った。その結果、着色が強い胎盤組織を効率よく脱色し、十分な透明度が得られるプロトコルを確立することができた。また、このプロトコルで有効な蛍光核染色法についても検討を行い、使用可能な色素（propidium iodide）を選定することができた。（２）胎盤をグリア線維性酸性蛋白質（GFAP）に対する得意抗体を用いて免疫染色細胞を行った。胎盤全視野にわたる高倍率観察を行ったところ、胎盤組織中にGFAP陽性を示す長い突起状構造物が走行していることを見出した。現在、この突起の起点と終点を明らかにするため、3次元的画像解析を行っている。本研究により得られる成果は、血液胎盤関門に関する新たな解釈の提案につながる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
（１）本研究の遂行において、広範囲かつ深部観察を可能とする胎盤の組織透明化は非常に有効であると期待される。しかしながら、これまで報告された組織透明化技術では、胎盤は十分に透明にはならない。この点については、我々が開発した組織透明化プロトコルを用いて、2mm程度の厚切り切片であればほぼ全層観察が可能であることが分かった。蛍光観察において免疫染色と共に核染色を用いることが望ましいが、我々の方法を含むこれまでの組織透明化プロトコルでは、組織透明化処理後の画像解析に耐えられる核染色像を維持することが困難であった。この問題に対して、核染色の色素をDNAに固定する方法について検討を行った。その結果、色素の種類にもよるが、白金製剤を使用することで、DNA二重鎖にとりこまれた蛍光色素を強固に固定できることが分かった。（２）絨毛間腔に面する合胞体性栄養膜および間腔内部に突出するように並ぶドット状のGFAP陽生構造物について、さらに詳細な観察を行った。GFAP染色を施したマウス胎盤をCV7000 (Yokogawa)を用いて全エリアの高倍率タイリング撮影を行い、膨大な数の取得画像から全画面を再構築し、GFAP陽性構造物の全体像を描出することができた。その結果、GFAP陽性構造物は数百ミクロン以上の非常に長い突起状の構造を呈しており、labyrinthine trophoblastsの間質を長い距離にわたって走行していることが明らかとなった。現在、突起の起始と停止について解析を進めている。（３）DiI染色を維持できる透明化プロトコルを確立することはできていない。昨年度までの研究によって、GFAP陽性突起は非常に長い距離にわたって胎盤内を走行していることが予想されるため、XY面の広視野観察に加えて、Z方向の深部観察が要求される。
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| Strategy for Future Research Activity |
（１）組織透明化処理に耐える核染色法の開発を行う。（２）DiI染色を維持することが可能な組織透明化プロトコルの改良を行う。DiIを用いて、絨毛間腔と毛細血管を架橋する突起のトレースを試みる。すなわち、順行性標識：絨毛間腔にDiI懸濁液を注入・標識する。逆行性標識：胎児臍動脈から絨毛毛細血管にDiIを注入・標識する。（３）栄養膜、血管、基底膜などの組織中の部位を特定できる抗体とGFAP抗体の多重染色によって、GFAP陽性突起の起始および終端を明らかにする。（４）母胎間シグナルリレーでは、栄養膜のgp130下流にあるJAK2/STAT3経路の活性化が、二次メッセンジャーであるACTHの放出を促す。gp130/JAK2/STAT3のシグナル経路が母胎間の架橋構造を介しているのであれば、架橋構造に一致してリン酸化STAT3が検出されることが期待される。この点について、リン酸化STAT3とGFAPの二重染色による解析を行う。
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| Causes of Carryover |
実験動物の維持・管理のために人件費を確保していたが、適切な人材を確保することができなかった。しかし、抗体などの高額な薬品類を中心とする消耗品費が当初の予定額を超えて必要であったため、人件費をこれに充てた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度繰り越しとなる445千円は、メラノコルチン２受容体ノックアウトマウス導入のために使用される。内訳は、ノックアウトマウス受精卵が約300千円、胚移植費用ならびに系統樹立に必要な野生型マウス代として145千円を予定している。
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