Visualization of heavy-ion induced clustered DNA double strand break formation using super-resolution microscopy

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15K15449
• Research Institution: Sasaki Foundation
• Principal Investigator: 磯野 真由 公益財団法人佐々木研究所, 附属研究所, 研究員(移行) (90713511)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: DNAクラスター損傷 / 重粒子線 / 染色体異常

Outline of Annual Research Achievements

重粒子線はその粒子が通過した軌跡に沿って局所集中的に多種類のDNA損傷(クラスター損傷)を生み出す。その中でもDNA二本鎖切断(DSB)を含むクラスター損傷は、重粒子線によって誘発される細胞死の最大の要因だと考えられている。しかし現在まで、技術的限界により細胞レベルでクラスター損傷を正確に可視化出来ていない。本研究では次世代3D超高解像度顕微鏡OMXを用い、蛍光免疫染色法によって損傷部位をラベルすることで重粒子線誘発クラスター損傷の可視化を試みた。平成27年度以降、DSB末端に1-2分子のみ結合するKu70/80をDSB発生部位マーカーとして用い、重粒子線誘発DSB発生部位の同定を行った。Ku80 foci検出の条件検討を行い、Ku80 fociを可視化出来るようになった。しかしながらその後の解析では、X線照射後のDSB末端においてKu80 fociの検出効率は部分的であることが明らかになった。Ku80 fociの検出感度を上げるため、代替としてGFP-Ku80発現細胞株を作成しGFP-Ku80の検出を行った。しかしながらGFP-Ku80 fociは検出出来なかった。別のアプローチとして、重粒子線照射によって生じるDSBを検出するため、DSB末端の一本鎖DNA領域に集積するRPAのfociを対象に解析を行なった。その結果、重粒子線照射によって生じた１つのgH2AX foci内には複数のRPA fociが検出され、RPA foci同士は約700 nmの距離で近接していることを明らかにした。これは重粒子線照射では複数のDSBが非常に近接して生ずることを示しており、染色体内または染色体間での欠失や転座といった染色体異常の誘発を助長する要因となることが示唆された。

Research Products

• [Journal Article] BRCA1 directs the repair pathway to homologous recombination by promoting 53BP1 dephosphorylation (2017)
  • Author(s): Mayu Isono, Atsuko Niimi, Takahiro Oike, Yoshihiko Hagiwara, Hiro Sato, Ryota Sekine, Yukari Yoshida, Ryotaro Nishi, Elena Petricci, Shinichiro Nakada, Takashi Nakano and Atsushi Shibata
  • Journal Title: Cell Reports Volume: 18 Pages: 520-532
  • DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.celrep.2016.12.042
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] 炭素イオン線誘発DNA二本鎖切断の修復経路選択における線エネルギー付与の効果 (2016)
  • Author(s): 萩原慶彦，磯野真由，新美敦子，尾池貴洋，佐藤浩央，中野隆史，柴田淳史
  • Organizer: 第39回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 横浜市, 神奈川県
  • Year and Date: 2016-11-30 – 2016-12-02
• [Presentation] BRCA1 directs the repair pathway to homologous recombination by promoting 53BP1 dephosphorylation (2016)
  • Author(s): Mayu Isono, Atsuko Niimi, Yoshihiko Hagiwara, Ryotaro Nishi, Shinya Isobe, Chikashi Obuse, Elena Petricci, Shinichiro Nakada, Takashi Nakano and Atsushi Shibata
  • Organizer: The 10th 3R Symposium
  • Place of Presentation: Matsue, Shimane, Japan
  • Year and Date: 2016-11-13 – 2016-11-17
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] The effect of Linear Energy Transfer in DNA double strand break repair pathway choice in G2 cells (2016)
  • Author(s): Yoshihiko Hagiwara, Atsuko Niimi, Mayu Isono, Takahiro Oike, Hiro Sato, Takashi Nakano and Atsushi Shibata
  • Organizer: The 10th 3R Symposium
  • Place of Presentation: Matsue, Shimane, Japan
  • Year and Date: 2016-11-13 – 2016-11-17
  • Int'l Joint Research