Calcium imaging in spinal cord slices and in vivo spinal cord using calcium-sensitive fluorescent protein

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15K15565
• Research Institution: Niigata University
• Principal Investigator: 紙谷 義孝 新潟大学, 医歯学総合病院, 特任教授 (90381491)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 馬場 洋 新潟大学, 医歯学系, 教授 (00262436) ; 渡部 達範 新潟大学, 医歯学総合病院, 助教 (30748330)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 疼痛メカニズム / 一次知覚神経 / 脊髄後角 / 遺伝子導入 / カルシウムイメージング

Outline of Annual Research Achievements

アデノ随伴ウイルス（Adeno-associated virus：AAV）ベクターを用いて、マウスの一次知覚神経の後根神経節（DRG）に外来遺伝子を発現させるため、始めに遺伝子導入効率を検討した。導入効率を検討するためのAAVベクター（AAV5.CMV.TurboRFP.WPRE.rBG）5μl / bodyを脊髄くも膜下腔に投与し、その後、１週間・２週間・３週間後および比較対象として未処置(Naive)のマウスの脊髄およびDRGを採取し、組織学的染色法により検討した。
投与後２週間後のDRGにおいてAAVの感染はピークとみられることが示唆された。また、脊髄後角では投与１週間後に多いようだが、２週間後・３週間後とあまり変化はないように思われた。以上の結果より、使用したAAVベクターの蛍光色素が弱いこと、またはバックグラウンドの可能性が排除できないことから、はっきりとした感染効率の時間が確認できなかった。
次に、バックグラウンドなのか、実際に感染しているのか、感染しているとすれば時期はいつなのかを検討するため、AAVベクターを認識する抗体(Anti-RFP)を使用し、免疫組織化学染色法を1次抗体として使用し染色を行った。
1次抗体の濃度は、1:400, 1:800, 1:1600で検討し、2次抗体は蛍光強度の異なるCy3, Rhodamineを用いて1:1000, 1:2000で検討した。DRGではAAV投与後1週間後のDRGでRFP陽性細胞の数が多いように思われた。しかし、これはanti-RFPなしの染色時では2週間後がピークと思われた結果とはことなった結果となった。また、ネガティブコントロールとして使用したNaiveのDRG切片においても同様に染色した結果、わずかにanti-RFP陽性細胞の染色がみられた。(anti-RFP 1:400, Rhodamin 1:1000)