2015 Fiscal Year Research-status Report
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15K15629
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
大野 京子 東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (30262174)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
相原 一 東京大学, 医学部附属病院, 教授 (80222462)
吉田 武史 東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 講師 (30451941)
諸星 計 東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (60598415)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 眼発生・再生医学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
今年度は、次年度における強膜篩状板再生のために、まずラット眼において、ヒト線維芽細胞を視神経周囲に沿って注入し、移植された細胞が視神経周囲に沿って生着するかどうかを研究した。Wistarラット(オス；生後6週)を使用し、免疫抑制座としてFK506 1mg/kgを筋注した(移植前3日間、移植後5日/週)。移植細胞は、mAG-1を遺伝子導入したヒト線維芽細胞を培養後、細胞懸濁液(PBS希釈)を1万細胞個/μlになるように調整した。ラットは、ペントバルビタール腹腔内麻酔(40mg/kg)を施行後に、オキシブプロカイン点眼麻酔下に線維芽細胞を後部強膜に沿って30ゲージの鈍針で1万個を注入した。1週間後に灌流固定（ヘパリン加PBS(5U/ml)で左心室より還流、右心耳より脱血；2%パラホルムアルデヒドにて還流）を行って眼球を摘出し、2%PFAで後固定を行い、凍結切片を10μmで作成し、移植細胞の生着と部位を共焦点顕微鏡で観察した。しかし移植された細胞は後部強膜のすぐ後方に確認されたが、視神経周囲にはみられなかった。また、細胞注入後に結膜の切開部位から細胞が逆流することによる損失も多く見られた。
そこで、視神経により近い部位に注入すると考え、つぎにラットの上眼瞼皮膚を切開し、眼窩壁とテノン嚢の間を視神経方向に鈍的に剥離、その後視神経と思われる方向に針先を向けて30G鈍針でヒト線維芽細胞を約50-150万細胞個まで濃度を振って移植を行った。この方法では深部まで刺入でき、また結膜は切開せず注射を行うため、細胞懸濁液の漏れを少なくできると考えた。注入後の還流固定後の凍結切片の観察では、視神経周囲の強膜のすぐ後方に移植細胞を確認でき、また一部には視神経周囲硬膜の付近まで移植細胞が観察された。従って上記の手技改良により、視神経近傍に線維芽細胞を移植し生着させることが可能になった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
最初の方法のように、結膜を切開しそこから線維芽細胞を注入する方法では、切開創からの細胞混濁液の逆流などにより、生着細胞も少なく、また、視神経周囲にまで移植細胞が遊走することが困難であった。しかし、手技を改良し、結膜を切開せずに上眼瞼の皮膚を介して眼科壁とテノン嚢の間を通じ、視神経方向に細胞懸濁液を注入することにより、視神経周囲硬膜の部位まで線維芽細胞を注入でき、しかも1週間後の時点で移植された細胞が生着していることが確認された。初期段階では、細胞混濁液注入後に液が誤って脳脊髄液に迷入したためと思われる死亡がみられ、小動物で眼球周囲面積も小さいラットを用いることによる合併症もみられたが、上記のような手技の改良を重ねることにより、おおむね安定して視神経周囲に線維芽細胞を移植することができるようになった。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成27年度の進行状況を踏まえ、平成28年度以降には、移植された線維芽細胞がin situでコラーゲンを産生し、それが強膜篩状板方向に向かって産生されているかを確認する。注入手技が確立されたことから、ラット個体数を増加し線維芽細胞を視神経周囲に注入し、2週間後、4週間後の時点でヒトコラーゲンに特異的な抗体を用い、移植細胞によるコラーゲン産生の有無とその方向性を観察する。同時に電子顕微鏡を用いて産生コラーゲンの細線維の観察とヒトコラーゲン抗体を用いた免疫電顕を行う。さらに凍結切片において、強膜篩状板の厚さを測定し、細胞移植のコラーゲン産生により篩状板の肥厚が得られたか調べる。最後に、分担研究者の相原らが確立したフェレットの緑内障動物モデルを用い、フェレットの視神経周囲に向かって同様の手技でヒト線維芽細胞を注入し、移植細胞によるコラーゲン産生、篩状板の肥厚化を調べる。最後に、強膜篩状板再生により視神経障害が抑制できたかを明らかにするために、視神経断面の軸索数を、細胞移植をしていない緑内障眼と細胞移植をした実験的緑内障眼の間で比較検討する。注入手技に熟練した本学の研究者および緑内障モデルの実験に習熟した分担研究者の連携により本研究の遂行は十分可能であると考えられる。
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| Causes of Carryover |
強膜篩状板再生を目的に、ラットの視神経周囲に沿って間葉系幹細胞および線維芽細胞の注入を行ったところ、注入細胞が脳脊髄液に迷入したことによると推察される血流塞栓を生じたと考えられるラットの死亡が予想以上に多く発生し、再生効果を解析できるラットの数が不足するという問題点が生じた。そこで、細胞を視神経からやや離して注入するなどの手技の改良を試み、トライアンドエラーののちに結膜ではなく上眼瞼皮膚を通じて注入することにより、直後の死亡は回避できることが追加実験で判明した。
上記の手技の改善に当初の計画以上の時間がかかったこと、今後の解析にはさらに匹数が必要であること、視神経から離れた部位に注入された幹細胞が十分に視神経に遊走するかなど、手技の変更に伴い新たに検討すべき実験が必要になったために延長を必要とした。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
使用計画としましては、上記の細胞注入手技の改良に伴い、さらに上記手法の安全性、有効性を追加購入したラットで検討する必要がある。そのため、新規に実験用のラットを購入するとともに、動物飼育に関する経費にあてる必要がある。また、直後の死亡が回避できることを確認したうえで、長期的な移植細胞の生着とin situでのコラーゲン産生を明らかにするために、さらなる動物の購入および凍結切片作成およびヒトコラーゲンの免疫染色にかかる経費が必要である。さらに、GFP遺伝子導入したヒト線維芽細胞および間葉系幹細胞の確立、培養に関する経費が必要である。上記を確認したうえで、さらに本方法の緑内障性視神経障害に対する有効性を解明するためにフェレット緑内障モデルを用いる。フェレットの飼育、管理にかかる経費も必要である。
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[Journal Article] Association between the CDKN2B-AS1 gene and primary open angle glaucoma with high myopia in Japanese patients.2015
Author(s)
Kimura Y, Akagi T, Miyake M, Yamashiro K, Yoshikawa M, Yamada H, Hasegawa T, Suda K, Nakanishi H, Ohashi-Ikeda H, Gotoh N, Hangai M, Moriyama M, Ohno-Matsui K, Yoshimura N.
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Journal Title
Ophthalmic Genetics
Volume: 2
Pages: 1-3
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] Identification of myopia-associated WNT7B polymorphisms provides insights into the mechanism underlying the development of myopia.2015
Author(s)
Miyake M, Yamashiro K, Tabara Y, Suda K, Morooka S, Nakanishi H, Khor CC, Chen P, Fan Q, Nakata I, Akagi-Kurashige Y, Gotoh N, Tsujikawa A, Meguro A, Kusuhara S, Polasek O, Hayward C, Wright AF, Campbell H, Richardson AJ, Schache M, Takeuchi M, Mackey DA, Hewitt AW, Cuellar G, Shi Y, Moriyama M, Ohno-Matsui K, et al.
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Journal Title
Nature Communications
Volume: 6
Pages: 6689
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] International photographic classification and grading system for myopic maculopathy.2015
Author(s)
Ohno-Matsui K, Kawasaki R, Jonas JB, Cheung CMG, Saw SM, Verhoeven VJ, Klaver CC, Moriyama M, Shinohara K, Kawasaki Y, Yamazaki M, Meuer S, Ishibashi T, Yasuda M, Yamashita H, Sugano A, Wang JJ, Mitchell P, Wong TY, for the META-analysis for Pathologic Myopia (META-PM) Study Group.
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Journal Title
American Journal of Ophthalmology
Volume: 159
Pages: 877-883
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
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