2015 Fiscal Year Research-status Report

オッセオインテグレーションとバイオインテグレーションの本質を細胞サイドから探る

Research Project

Project/Area Number	15K15741
Research Institution	The University of Tokushima
Principal Investigator	宮本洋二徳島大学, 大学院医歯薬学研究部, 教授 (20200214)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	玉谷哲也徳島大学, 大学病院, 講師 (30274236) 高丸菜都美徳島大学, 大学病院, 助教 (40513031) 永井宏和徳島大学, 大学院医歯薬学研究部, 准教授 (50282190) 大江剛徳島大学, 大学病院, 助教 (60432762)
Project Period (FY)	2015-04-01 – 2017-03-31
Keywords	ヒト骨髄間葉系幹細胞 / マイクロアレイ解析 / イオンプレーティング法
Outline of Annual Research Achievements	イオンプレーティング法を用いることによって、ガラスディッシュ表面にチタン、金およびステンレスをコーティングして、表面粗さや表面形状が同一で材質だけがことなる試料を作成した。これらディッシュ（チタン、金、ステンレス、ガラス）上で、ヒト骨髄間葉系幹細胞（hMSC-BM: Promo Cell No C-12974）を６時間培養し、RNAを回収した。cDNAのマイクロアレイを用いて、遺伝子の発現を解析した。遺伝子発現変化の網羅的解析はtoal RNAを逆転写してcDNAを作製後、Affymetrix社製 Gene Chip cDNAマイクロアレイキットを用いて解析し、発現変化を認めた候補遺伝子が確認できた。チタン上で２倍以上の発現変化を示した遺伝子を検索し、ガラスに対して78遺伝子、金に対して115遺伝子、ステンレスに対して115遺伝子を同定した。さらに、total RNAをTaqMan® cDNA Reverse Transcription (RT) Kit(Applied Biosystems)により逆転写し、ABI PRISM 7000 Sequence Detection SystemとTaqMan®Gene Expression AssaysによるリアルタイムPCR法を用いてmRNAレベルでの発現を確認中である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason ガラスディッシュ表面をチタン、金、ステンレスでコーティングして、ヒト骨髄間葉系幹細胞を培養し、マイクロアレイによる解析を行い、発現変化を認めた候補遺伝子が確認した。さらに候補遺伝子のmRNAレベルでの発現をリアルタイムPCR法にて確認した。本年度の計画では、タンパクを回収し、標的タンパクの発現確認までを予定していたが、細胞の増殖とガラスディッシュのコーティングに時間を要したが、順調に進行している。
Strategy for Future Research Activity	ディッシュ（チタン、金、ステンレス、ガラス）上で、ヒト骨髄間葉系幹細胞を６時間培養し、RNAを回収する。Affymetrix社製human miRNAマイクロアレイキット(V2)を用い、miRNAの発現を解析する。候補となったmiRNAをリアルタイムPCR法を用いて発現を確認する。 miRNAマイクロアレイ時と同様の条件で、各種ディッシュ上で培養したhMSC-BMからタンパクを回収し、Western Blotting法により標的タンパクの発現を検討する。このとき、標的タンパクの発現を大きく変化させた候補miRNAを選択し、リアルタイムPCRを用いて候補遺伝子の発現を確認し、候補mRNAに対する標的タンパクの発現確認を行う。また、候補miRNAの標的タンパクに対する抗体を用いて発現の確認を行う。さらに、ヒト間葉系幹細胞をターゲットとして遺伝子およびmRNA発現を解析するだけでなく、骨芽細胞を用いて同様の研究をすすめていく。
Causes of Carryover	マイクロアレイ解析による候補遺伝子を確認したが、miRNA、タンパク発現の確認には至っておらず、次年度の課題とした。そのため、miRNA , Western Blotting法に使用する試薬・機器の購入ができていないためである。
Expenditure Plan for Carryover Budget	miRNAマイクロアレイを行う。また、各種ディッシュ上で培養したhMSC-BMからタンパクを回収し、Western Blotting法により標的タンパクの発現を検討する。miRNAとWestern Blotting法に使用する試薬・機器の購入を予定している。