2015 Fiscal Year Research-status Report

ユビキチン依存的DNA-PK活性化が導く抗がん剤感受性のメカニズム解明

Research Project

Project/Area Number	15K16127
Research Institution	Kanazawa Medical University
Principal Investigator	逆井良金沢医科大学, 医学部, 助教 (10549950)
Project Period (FY)	2015-04-01 – 2018-03-31
Keywords	DNA二本鎖切断 / 非相同末端連結 / 相同組換え
Outline of Annual Research Achievements	DNAの二本鎖切断（DSB）は非常に重篤なDNA損傷として知られ、相同組換え修復（HR）と非相同末端連結（NHEJ）の２つの経路で修復されることがわかっている。一方、DNA切断端が１つしかない様なDSB（one-ended DSB）がDNA複製を介して生じることがある。この場合、NHEJの基質としては不適切であり、HRが主な修復経路と考えられている。カンプトテシン（CPT）は、one-ended DSBを引き起こす抗がん剤であり、HR欠損細胞はCPTに対し感受性を示す。これに対し、NHEJ欠損細胞はCPTに抵抗性を示すことが明らかとなり、NHEJを介した不適切な修復が細胞死の引き金と考えられる。したがって、one-ended DSBに対するNHEJ機構の解明は、CPTの奏功性を考える上で重要となる。 CPTによるone-ended DSBに対して、NHEJ因子であるDNA-PKはUbcH5ファミリーが関与するユビキチン化依存的に活性化することを明らかにしてきた。本研究では、UbcH5によるDNA-PK経路活性化の制御メカニズム、および、抗がん剤応答への影響を解明することを目的としている。そこで、UbcH5ファミリーと関連したE3ユビキチンリガーゼに対する二次スクリーニングを行い、E3リガーゼSIAH1を新規DNA-PK活性化因子として同定した。DNA末端を削り、HR経路へと進ませるDNA end resection反応にかんしては、SIAH1によるDNA-PKの活性化とは独立していることを明らかにした。おそらくはDNA-PK関連因子であるKuタンパク質の制御であると考えられるが、免疫染色によるKuタンパク質の検出が難しく、現在条件検討を進めている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason siRNAスクリーニングにより、新規DNA-PK制御因子としてSIAH1を同定し、SIAH1によるDNA-PK活性化制御がDNA end resectionとは関連しないことを明らかにした。おそらくはDNA-PKをDSB末端へとつなぎとめるKuタンパク質をSIAH1が制御している可能性が考えられる。しかし、Kuタンパク質は細胞内のタンパク質量も多く、ターンオーバーも長いため、ノックダウンによるNHEJの抑制がうまくいっておらず、CPTによるDNA-PK活性化がKuに依存しているかについての検討が難航している。また、免疫染色によるKuの局在についての解析も難しく、現在条件検討を進めている。また、細胞死の原因と考えられる染色体異常についても解析を進めているが、SIAH1ノックダウン細胞での解析に難航している。
Strategy for Future Research Activity	研究協力先である群馬大学で、高解像度顕微鏡を使ったKuタンパク質の検出を行いたいと考えている。また、同様の機器を用いて、レーザー照射によりDNA一本鎖切断を誘導し、DNA複製依存的なone-ended DSBを誘導する実験系の構築を進めているところである。局所にone-ended DSBを誘導できれば、Kuタンパク質の局在も観察しやすくなると考えられる。 KuのDNA-PK活性化に対する依存性については、Kuのコンディショナルノックアウト細胞を用いることを検討しており、ノックダウンでは不可能だった現象が見えてくることが予想される。染色体異常については、最近、コヒーシンタンパク質が関与することが報告され、コヒーシンタンパク質のノックダウンと組み合わせることで、染色体異常検出の感度上昇を図る予定である。
Causes of Carryover	one-ended DSBに対するDNA-PK経路の解析として、制御E3リガーゼとしてSIAH1を同定するに至り、DNA end resectionとの関係性は明らかにしたが、Kuタンパク質に関する解析が難航している。さらに、染色体異常解析もうまくいっていないことにより、研究全体としては遅れ気味であるため、当該年度の使用額が減少し、次年度に使用することとなった。
Expenditure Plan for Carryover Budget	Kuタンパク質解析および染色体異常解析については、今後の推進方策に従い速やかに実施していく。これらの課題が解消されれば、当初の予定通り、one-ended DSBへの修復因子の局在や、細胞周期や抗がん剤感受性へのUbcH5-SIAH1-DNA-PK経路の影響について、解析を進めていく。