ネコにおける有機ハロゲン化合物の代謝機構解明と甲状腺機能の影響評価

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K16132
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 水川 葉月 北海道大学, (連合)獣医学研究科, 助教 (60612661)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: ネコ / 有機ハロゲン化合物 / 代謝能 / 肝ミクロソーム / 甲状腺機能亢進症

Outline of Annual Research Achievements

本申請研究では、社会的関心の高いペット動物の化学物質汚染と健康リスクに焦点を当て、とくにネコ体内に残留する有機ハロゲン代謝物の体内レベルや体内動態、代謝排泄能の解明を目的とし、甲状腺機能障害に及ぼす影響の検証を試みる。
本年度は、ハウスダストからの暴露寄与が大きいポリ臭素化ジフェニルエーテル（PBDEs）の体内変化を明らかにするために、実験動物として飼育されているネコにこれらを投与してin vivoでの動態試験を開始した。現在までに、飼養期間の半分が経過し、経時的に採血・糞尿を採取している。これらの試料は順次化学分析を実施し、PBDEおよび水酸化代謝物（OH-PBDEs）、甲状腺ホルモン量などを計測後、カイネティックモデルを構築する予定である。
また、液体クロマトグラフ・質量分析計（LC-MS/MS）を用いたOH-PBDEsの分析法を立ち上げ、血清中のOH-PBDEs濃度分析が可能となった。今後は、本法を用いて、ネコ血清の分析を実施する。
さらに、ポリ塩化部フェニル（PCBs）をネコに投与し、体内動態や代謝排泄能を明らかにするため経時採血したところ、血清中OH-PCBs濃度は低塩素化体の残留が顕著であり、同条件で実施したイヌのin vivo試験と比較した結果、異性体の残留パターンや体内動態にイヌとネコで種差が観察された。また、代謝酵素活性および遺伝子解析の結果、PCBs暴露によりEROD、MROD、PROD活性は上昇するものの、第2相抱合酵素（UGTやSULT）活性は変化せず、PCBs暴露による抱合酵素活性への影響もみられなかった。また、CYP1A1およびCYP1A2遺伝子の発現量の上昇も認められた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度の目的であるネコを用いたin vivo投与試験については計画通り実施を開始し、順調に試料採取も進んでいる。
有機ハロゲン化合物の体内動態や代謝排泄能の解明に関しては、PCBsの生体内動態および代謝機序の一端を明らかにすることができた。

Strategy for Future Research Activity

in vivo投与試験後のネコの血液、肝臓、胆汁、尿中の水酸化代謝物や抱合体化物を分析し、親化合物との関係を解析して代謝能力を検証し、PBDEsの代謝排泄能を評価する。PBDEsの抱合体化物は、蛍光検出器や高速液体クロマトグラフィー・質量分析計（HPLC-MS）を用いて分析する。ヒト尿中からPBDEsの代謝物として考えられるブロモフェノール抱合体（グルクロン酸抱合体、硫酸抱合体）を分析した研究が報告されており、ペットの組織中抱合体化物の分析には既報を適用する。さらに、in vivo試験により得られたネコの肝臓を供試して第I相、第II相反応に関わる薬物代謝酵素（CYPs）や抱合酵素（UDP-GT、GST、SULT）の活性測定や遺伝子を抽出・クローニングして配列を決定し、代謝機構を解明するとともに、甲状腺機能撹乱メカニズムの解明とリスク評価のための科学的根拠を提示する。酵素活性は薬物代謝酵素のアッセイ法として公知のAROD法や、抱合酵素のUDPGT、GST活性測定キット（UGT Glo assayやGST assay kit）を用いて算出する。
OH-PCBsやOH-PBDEsは、生体内で甲状腺ホルモン輸送タンパク（TTR）に結合し残留している。ネコにおいてOH-PCBsの残留組成が他の陸棲哺乳類と異なることから、第I相・第II相代謝能のみならず、甲状腺ホルモン輸送タンパクへの結合にも種差があると考えられる。そこで、ネコおよび実験動物（マウスやラット、イヌ）の肝臓組織を用いて、甲状腺ホルモン輸送タンパクとの競合結合試験を行い、結合能を生物種差によって評価する。

Remarks

American Chemical Society（ACS）のNEWSでHot topicに選出（ACS News Service Weekly PressPac: January 06, 2016）
「Fish-flavored cat food could contribute to feline hyperthyroidism」

Research Products

• [Int'l Joint Research] Kasetsart University(タイ)
  • Country Name: THAILAND
  • Counterpart Institution: Kasetsart University
• [Journal Article] Organohalogen compounds in pet dog and cat: Do pets biotransform natural brominated products in food to harmful hydroxlated substances? (2016)
  • Author(s): Mizukawa H, Nomiyama K, Nakatsu S, Iwata H, Yoo J, Kubota A, Yamamoto M, Ishizuka M, Ikenaka Y, Nakayama M.M.S, Kunisue T, Tanabe S
  • Journal Title: Environmental Science & Technology Volume: 50 Pages: 444-452
  • DOI: 10.1021/acs.est.5b04216
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] In vitro and in silico analyses for predicting hepatic cytochrome P450-dependent metabolic potencies of polychlorinated biphenyls in the Baikal seal. (2015)
  • Author(s): Yoo J, Hirano M, Mizukawa H, Nomiyama K, Agusa T, Kim E-Y, Tanabe S, Iwata H.
  • Journal Title: Environmental Science & Technology Volume: 49 Pages: 14588-14596
  • DOI: 10.1021/acs.est.5b03890
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] UGT Xenobiotic metabolizing activity and genetic evolution in Pinniped species (2015)
  • Author(s): Kakehi M, Ikenaka Y, Nakayama M.M.S, Kawai Y.K, Watanabe K.P, Mizukawa H, Nomiyama K, Tanabe S, Ishizuka M
  • Journal Title: Toxicological Sciences Volume: 147 Pages: 360-369
  • DOI: 10.1093/toxsci/kfv144
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Characterization and tissue distribution of conjugated metabolites of pyrene in the rat (2015)
  • Author(s): Saengtienchai A, Ikenaka Y, DarwishWS, Nakayama M.M.S, Mizukawa H, Ishizuka M
  • Journal Title: The Journal of Veterinary Medical Science Volume: 77 Pages: 1261-1267
  • DOI: 10.1292/jvms
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Organohalogens and their hydroxylated metabolites in the blood of pigs from an open waste dumping site in south India: Association with hepatic cytochrome P450 (2015)
  • Author(s): Mizukawa H, Nomiyama K, Kunisue T, Watanabe MX, Subramanian A, Iwata H, Ishizuka M, Tanabe S
  • Journal Title: Environmental Research Volume: 138 Pages: 255-263
  • DOI: 10.1016/j.envres.2015.02.012
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] ポリ塩化ビフェニル（PCBs）のin vivo暴露によるネコの異物代謝解明と甲状腺ホルモンへの影響評価 (2016)
  • Author(s): 水川葉月、前原美咲、横山望、市居修、滝口満喜、野見山桂、西川博之、池中良徳、中山翔太、高口倖暉、田辺信介、石塚真由美
  • Organizer: 第43回日本毒性学会
  • Place of Presentation: ウィングあいち、愛知
  • Year and Date: 2016-06-29 – 2016-07-01
• [Presentation] ネコにおけるポリ塩化ビフェニル（PCBs）の異物代謝機構解明と甲状腺ホルモンへの影響評価 (2016)
  • Author(s): 水川葉月、前原美咲、横山望、市居修、滝口満喜、野見山桂、西川博之、池中良徳、中山翔太、高口倖暉、田辺信介、石塚真由美
  • Organizer: 第25回環境化学討論会
  • Place of Presentation: 朱鷺メッセ、新潟
  • Year and Date: 2016-06-08 – 2016-06-10
• [Presentation] 有機ハロゲン化合物によるコンパニオンアニマルの汚染実態と甲状腺ホルモンへの影響評価 (2016)
  • Author(s): 野見山 桂、山本 恭央、水川 葉月、江口 哲史、滝口 満喜、中山 翔太、池中 良徳、石塚 真由美、国末 達也、田辺 信介
  • Organizer: 第25回環境化学討論会
  • Place of Presentation: 朱鷺メッセ、新潟
  • Year and Date: 2016-06-08 – 2016-06-10
• [Presentation] メタボローム解析を用いたPCBsによるイエネコの毒性影響評価 (2016)
  • Author(s): 西川博之、野見山桂、水川葉月、横山望、市居修、滝口満喜、石塚真由美、池中良徳、中山翔太、江口哲史、国末達也、田辺信介
  • Organizer: 第25回環境化学討論会
  • Place of Presentation: 朱鷺メッセ、新潟
  • Year and Date: 2016-06-08 – 2016-06-10
• [Presentation] 非実験動物における化学物質代謝能の特徴と種差 (2016)
  • Author(s): 池中良徳、筧麻友、水川葉月、中山翔太、石塚真由美
  • Organizer: 日本薬学会第136年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜、神奈川
  • Year and Date: 2016-03-26 – 2016-03-29
  • Invited
• [Presentation] BIOTRANSFORMATION POTENCIES OF POLYCHROLINATED BIPHENYLS IN CATS (2016)
  • Author(s): Hazuki Mizukawa, Misaki Maehara, Nozomu Yokoyama, Osamu Ichii, Mitsuyoshi Takiguchi, Kei Nomiyama, Yoshinori Ikenaka, Shouta M.M. Nakayama, Shinsuke Tanabe, Mayumi Ishizuka
  • Organizer: INTERNATIONAL SYMPOSIUM ON ENVIRONMENTAL CHEMISTRY AND TOXICOLOGY – TO ACCELERATE A GLOBAL NETWORK OF ENVIRONMENTAL RESEARCHERS
  • Place of Presentation: Matsuyama, Ehime, Japan
  • Year and Date: 2016-03-19 – 2016-03-19
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Metabolism and biotransformation of organohalogen compounds in the liver microsomes of cats and dogs (2015)
  • Author(s): Hazuki Mizukawa, Kei Nomiyama, Nozomu, Yokoyama, Osamu Ichii, Mitsuyoshi Takiguchi, Yoshinori Ikenaka, Shouta M.M. Nakayama,Misaki Maehara, Shinsuke Tanabe, Mayumi Ishizuka
  • Organizer: SETAC North America 36th Annual Meeting
  • Place of Presentation: Salt Palace Convention Center, Salt Lake City, USA
  • Year and Date: 2015-11-01 – 2015-11-05
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Omics approach of proteomic and metabolomic analysis for PCBs toxicity in the dog brain (2015)
  • Author(s): Kohki Takaguchi, Kei Nomiyama, Lauan M. Claret, Momoko Kusaki, Jean Yoo, Hazuki Mizukawa, Hisato Iwata, Tatsuya Kunisue, Shinsuke Tanabe.
  • Organizer: SETAC North America 36th Annual Meeting
  • Place of Presentation: Salt Palace Convention Center, Salt Lake City, USA
  • Year and Date: 2015-11-01 – 2015-11-05
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Contamination status of organohalogen compounds and their hydroxylated metabolites in pet cats: effects on thyroid hormones homeostasis (2015)
  • Author(s): Yasuo Yamamoto, Kei Nomiyama, Hazuki Mizukawa, Mitsuyoshi Takiguchi, Mayumi Ishizuka, Tatsuya Kunisue, Shinsuke Tanabe
  • Organizer: SETAC North America 36th Annual Meeting
  • Place of Presentation: Salt Palace Convention Center, Salt Lake City, USA
  • Year and Date: 2015-11-01 – 2015-11-05
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Phase II xenobiotic metabolizm in carnivora -UGT activity and genomestructure in Pinniped species- (2015)
  • Author(s): Yoshinori Ikenaka, Mayu Kakehi, Shouta Nakayama, Hazuki Mizukawa, Mayumi Ishizuka
  • Organizer: 7th SETAC Africa Conference
  • Place of Presentation: Langebaan, South Africa
  • Year and Date: 2015-10-05 – 2015-10-08
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 第 II 相抱合反応の種差：食肉目におけるグルクロン酸抱合酵素の進化と遺伝子構造 (2015)
  • Author(s): 池中良徳 、筧 麻友、中山翔太、川合佑典、渡邊研右、水川葉月、野見山 桂、田辺信介、石塚真由美
  • Organizer: 第24回環境化学討論会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター、北海道
  • Year and Date: 2015-06-24 – 2015-06-26
• [Presentation] メタボローム解析によるイヌ脳中PCBs, OH-PCBsの毒性影響評価 (2015)
  • Author(s): 野見山 桂、江口哲史、水川葉月、Yoo Jean、高口倖暉、山本泰央、忍穂井 智子、岩田久人、国末達也、田辺信介
  • Organizer: 第24回環境化学討論会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター、北海道
  • Year and Date: 2015-06-24 – 2015-06-26
• [Presentation] ポリ塩化ビフェニル（PCBs）を曝露したイヌの脳プロテオーム解析による毒性影響評価 (2015)
  • Author(s): 高口倖暉、野見山桂、Lauan Maria Claret 、草木桃子、Yoo Jean、水川葉月、岩田久人、国末達也、田辺信介
  • Organizer: 第24回環境化学討論会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター、北海道
  • Year and Date: 2015-06-24 – 2015-06-26
• [Presentation] ポリ塩化ビフェニル（PCBs）曝露によるイヌ異物代謝酵素シトクロムP450発現への影響評価 (2015)
  • Author(s): 田村沙弥、劉 珍、水川葉月、阿草哲郎、平野将司、野見山 桂、田辺信介、金 恩英、岩田久人
  • Organizer: 第24回環境化学討論会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター、北海道
  • Year and Date: 2015-06-24 – 2015-06-26
• [Presentation] ペットネコにおける有機ハロゲン化合物および水酸化代謝物の汚染実態と甲状腺ホルモン恒常性への影響 (2015)
  • Author(s): 山本恭央、野見山桂、水川葉月、滝口満喜、石塚真由美、国末達也、田辺信介
  • Organizer: 第24回環境化学討論会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター、北海道
  • Year and Date: 2015-06-24 – 2015-06-26
• [Remarks] 北海道大学大学院獣医学研究科毒性学教室HP
  • URL: http://tox.vetmed.hokudai.ac.jp/
• [Remarks] 北海道大学大学院獣医学研究科毒性学教室Facebook
  • URL: https://www.facebook.com/tox.vetmed.hokudai/