ネコにおける有機ハロゲン化合物の代謝機構解明と甲状腺機能の影響評価

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K16132
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 水川 葉月 北海道大学, 獣医学研究科, 助教 (60612661)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: ネコ / PBDEs / 脱臭素化 / 甲状腺ホルモン / in vivo / 甲状腺機能亢進症 / 生化学マーカー

Outline of Annual Research Achievements

本申請研究では、社会的関心の高いペット動物の化学物質汚染と健康リスクに焦点を当て、とくにネコ体内に残留する有機ハロゲン代謝物の体内レベルや体内動態、代謝排泄能の解明を目的とし、甲状腺機能障害に及ぼす影響の検証を試みる。
本年度は、ポリ臭素化ジフェニルエーテル（PBDEs）の体内変化を明らかにするために、昨年度より継続して実験動物として飼育されているネコにPBDEsの異性体の一種であるBDE209を投与し、in vivoでの動態試験を行った。供試したネコから経時的に血清・糞尿を採取し、分析まで‐20℃で保存した。投与開始より54週後の飼養期間終了時に獣医師による甲状腺機能亢進症の診断を行った。その結果、食欲増進や体重減少、活動増加といった臨床症状は認められなかったが、PBDE投与群でのみ膝窩リンパ節の蝕知が認められた。飼養期間終了後には、臓器・組織を採取し、‐20℃もしくは‐80℃にて保存した。経時採血した血清を用い、甲状腺ホルモン（総T4、遊離T4、総T3、遊離T3、リバースT3）濃度を分析したところ、両群に有意な差は認められず、また値も正常範囲内であった。また、24週目には肝酵素であるアルカリホスファターゼ（ALP）がPBDE投与群で有意に高値を示したが、その他の肝酵素や腎酵素に有意な差はなく、他の採血週においても差は認められなかった。投与開始後0.5h、1h、3h、6h、20h、6週目、12週目、18週目、24週目、30週目、36週目、42週目、48週目、54週目の血清中PBDEs濃度を測定したところ、体内に取り込まれたBDE209は18週目まで増加し、その後24週目にかけて大きく減少、以降は定常状態を示した。また、投与6時間目からBDE209の脱臭素化であるNona-BDEsが、12週目からOcta-BDEsが確認された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度の目的であるin vivo PBDE投与試験について、計画通り終了し、様々な臓器組織を得ることが出来た。また、獣医師による臨床診断や、血清中バイオマーカー（肝酵素、腎酵素、ステロイド等）測定も実施した。また、採取した臓器・組織を供試して、ネコ体内のPBDEsおよびその代謝物濃度について、測定を開始している。また、第I相水酸化酵素であるシトクロムP450や第II相抱合酵素であるグルクロン酸抱合酵素、硫酸抱合酵素の活性測定や遺伝子発現量解析に向けた前処理を実施しており、測定を進める準備が整っている。さらに、甲状腺ホルモン濃度の分析についても分析を行う準備が整っている。

Strategy for Future Research Activity

in vivo投与試験後のネコの血液、肝臓、胆汁、尿中の水酸化代謝物や抱合体化物を分析し、親化合物との関係を解析して代謝能力を検証し、PBDEsの代謝排泄能を評価する。PBDEsの抱合体化物は、脱抱合体化させ蛍光検出器や高速液体クロマトグラフィー・質量分析計（HPLC-MS）を用いて分析する。ヒト尿中からPBDEsの代謝物として考えられるブロモフェノール抱合体（グルクロン酸抱合体、硫酸抱合体）を分析した研究が報告されており、ペットの組織中抱合体化物の分析には既報を適用する。さらに、in vivo試験により得られたネコの肝臓を供試して第I相、第II相反応に関わる薬物代謝酵素（CYPs）や抱合酵素（UDP-GT、GST、SULT）の活性測定や遺伝子を抽出・クローニングして配列を決定し、代謝機構を解明するとともに、甲状腺機能撹乱メカニズムの解明とリスク評価のための科学的根拠を提示する。酵素活性は薬物代謝酵素のアッセイ法として公知のAROD法や、抱合酵素のUDPGT、GST活性測定キット（UGT Glo assayやGST assay kit）を用いて算出する。
OH-PCBsやOH-PBDEsは、生体内で甲状腺ホルモン輸送タンパク（TTR）に結合し残留している。ネコにおいてOH-PCBsの残留組成が他の陸棲哺乳類と異なることから、第I相・第II相代謝能のみならず、甲状腺ホルモン輸送タンパクへの結合にも種差があると考えられる。そこで、ネコおよび実験動物（マウスやラット、イヌ）の肝臓組織を用いて、甲状腺ホルモン輸送タンパクとの競合結合試験を行い、結合能を生物種差によって評価する。

Research Products

• [Int'l Joint Research] カセサート大学(タイ)
  • Country Name: THAILAND
  • Counterpart Institution: カセサート大学
• [Int'l Joint Research] モンゴル国立農業大学(モンゴル)
  • Country Name: MONGOLIA
  • Counterpart Institution: モンゴル国立農業大学
• [Journal Article] 非実験動物における化学物質代謝能の特徴と種差 Characterization of species differences of xenobiotic metabolism in non-experimental animals (2017)
  • Author(s): 水川葉月、池中良徳、筧麻友、中山翔太、石塚真由美
  • Journal Title: YAKUGAKU ZASSHI Volume: 137 Pages: 257-263
  • DOI: 10.1248/yakushi.16-00230-2
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Characterization of Equine Cytochrome P450: Role of CYP3A in the Metabolism of Diazepam. (2016)
  • Author(s): Nakayama SMM, Ikenaka Y, Hayami A, Mizukawa H, Darwish WS, Watanabe KP, Kawai YK, Ishizuka M.
  • Journal Title: Journal of Veterinary Pharmacology and Therapeutics. Volume: 39 Pages: 478-487
  • DOI: 10.1111/jvp.12303.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] The African hedgehog (Atelerix albiventris): low phase I and phase II metabolism activities. (2016)
  • Author(s): Saengtienchai A, Ikenaka Y, Bortey-Sam N, Jermnark U, Mizukawa H, Kawai YK, Nakayama SMM, Ishizuka M.
  • Journal Title: Comp Biochem Physiol C Pharmacol Toxicol. Volume: 190 Pages: 38-47
  • DOI: 10.1016/j.cbpc.2016.08.005.
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] 代謝酵素の動物種差 (2017)
  • Author(s): 石塚真由美、中山翔太、水川葉月、池中良徳
  • Organizer: 日本薬学会第137年会シンポジウム
  • Invited
• [Presentation] 化学物質の汚染環境に生きる野生動物の適応戦略 (2016)
  • Author(s): 石塚真由美、中山翔太、水川葉月、池中良徳
  • Organizer: 一般社団法人日本環境化学会25周年記念講演会：「環境化学の今、そして未来へ－環境化学からの提言－」
  • Place of Presentation: 発明会館地下ホール、東京都港区
  • Year and Date: 2016-11-16 – 2016-11-16
  • Invited
• [Presentation] Characteristic for biotransformation of polychrolinated biphenyls in cats (2016)
  • Author(s): Hazuki Mizukawa, Misaki Maehara, Nozomu Yokoyama, Osamu Ichii, Mitsuyoshi Takiguchi, Kei Nomiyama, Hiroyuki Nishikawa, Yoshinori Ikenaka, Shouta M.M. Nakayama, Kohki Takaguchi, Shinsuke Tanabe, Mayumi Ishizuka
  • Organizer: The 7th SETAC World Congress/37th SETAC North America Annual Meeting
  • Place of Presentation: Rosen Shingle Creek, Orlando, FL, USA
  • Year and Date: 2016-11-06 – 2016-11-10
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Contamination status of organohalogen compounds and their hydroxylated metabolites in pet cats and dogs: effects on thyroid hormones homeostasis (2016)
  • Author(s): Kei Nomiyama, Yasuo Yamamoto, Hazuki Mizukawa, Mitsuyoshi Takiguchi, Akifumi Eguchi, Shouta M.M. Nakayama, Yoshinori Ikenaka, Mayumi Ishizuka, Tatsuya. Kunisue, Shinsuke Tanabe
  • Organizer: The 7th SETAC World Congress/37th SETAC North America Annual Meeting
  • Place of Presentation: Rosen Shingle Creek, Orlando, FL, USA
  • Year and Date: 2016-11-06 – 2016-11-10
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Cross omics analysis for PCBs toxicity in the dog brain -Effect of mitochondria function- (2016)
  • Author(s): Kohki Takaguchi, Kei Nomiyama, Lauan Maria Claret, Momoko Kusaki, Jean Yoo, Hazuki Mizukawa, Hisato Iwata, Tatsuya Kunisue, Shinsuke Tanabe
  • Organizer: The 7th SETAC World Congress/37th SETAC North America Annual Meeting
  • Place of Presentation: Rosen Shingle Creek, Orlando, FL, USA
  • Year and Date: 2016-11-06 – 2016-11-10
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] In vivo analysis of PCB metabolic capacities and effects on the thyroid hormone in cats (2016)
  • Author(s): Hazuki, Mizukawa, Misaki Maehara, Nozomu Yokoyama, Osamu Ichii, Mitsuyoshi Takiguchi, Kei Nomiyama, Hiroyuki Nishikawa, Kohki Takaguchi, Aksorn Saengtienchai, Tsend-ayush Sainnoxoi, Yoshinori Ikenaka, Shouta M.M. Nakayama, Shinsuke Tanabe, Mayumi Ishizuka
  • Organizer: The 9th International PCB Workshop
  • Place of Presentation: Kobe International Conference Center, Kobe, Japan
  • Year and Date: 2016-10-09 – 2016-10-13
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Toxicological assessment of PCBs and OH-PCBs in the brain of dogs using metabolomics approach (2016)
  • Author(s): Kei Nomiyama, Kohki Takaguchi, Akifumi Eguchi, Hazuki, Mizukawa, Jean, Yoo, Saya, Tamura, Tomoko, Oshihoi, Hisato, Iwata, Tatsuya, Kunisue, Shinsuke Tanabe
  • Organizer: The 9th International PCB Workshop
  • Place of Presentation: Kobe International Conference Center, Kobe, Japan
  • Year and Date: 2016-10-09 – 2016-10-13
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Disruption of mitochondrial functions by PCB exposure in the dog brain: Toxicological assessment using cross omics (2016)
  • Author(s): Kohki Takaguchi, Kei Nomiyama, Akifumi Eguchi, Lauan Maria Claret, Momoko Kusaki, Jean Yoo, Hazuki Mizukawa, Hisato Iwata, Tatsuya Kunisue, Shinsuke Tanabe
  • Organizer: The 9th International PCB Workshop
  • Place of Presentation: Kobe International Conference Center, Kobe, Japan
  • Year and Date: 2016-10-09 – 2016-10-13
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 野生げっ歯類の殺鼠剤の抵抗性メカニズムと非対象動物に対する毒性メカニズム (2016)
  • Author(s): 石塚真由美、中山翔太、水川葉月、池中良徳
  • Organizer: 日本哺乳類学会2016年度大会「企画シンポジウム：野生動物が関わる問題にどのように対応するか？～基礎研究を応用した解決への取り組み～」
  • Place of Presentation: 筑波大学、つくば市、茨城県
  • Year and Date: 2016-09-23 – 2016-09-26
• [Presentation] The effect of environmental pollutants to pet animals ~Level and effects of Persistent organic pollutants (POPs) to domestic cat~ (2016)
  • Author(s): Tsend-ayush Sainnokhoi, Hazuki Mizukawa, Misaki Maehara, Nozomu Yokoyama, Osamu Ichii, Mitsuyoshi Takiguchi, Kei Nomiyama, Aksorn Saengtienchai, Shinsuke Tanabe, Yoshinori Ikenaka, Shouta M.M. Nakayama, Mayumi Ishizuka
  • Organizer: The 4th Sapporo Summer Seminar for One Health (SaSSOH)
  • Place of Presentation: Hokkaido University, Sapporo, Japan
  • Year and Date: 2016-09-20 – 2016-09-21
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] UGT2Bサブファミリーに着目した食肉目におけるグルクロン酸抱合能の動物種差解明 (2016)
  • Author(s): 近藤誉充、池中良徳、中山翔太、水川葉月、Aksorn Saengtienchai、Yared Beyene、坂本健太郎、和田昭彦、服部薫、三谷曜子、田辺信介、野見山桂、石塚真由美
  • Organizer: 平成28年度内外環境応答・代謝酵素研究会
  • Place of Presentation: 静岡県立大学薬学部、静岡市、静岡県
  • Year and Date: 2016-09-17 – 2016-09-18
• [Presentation] 野生動物及び実験動物におけるグルクロン酸抱合酵素の動物種差解明 (2016)
  • Author(s): 近藤誉充、池中良徳、中山翔太、水川葉月、Aksorn Saengtienchai、Yared Beyene、坂本健太郎、和田昭彦、服部薫、三谷曜子、田辺信介、野見山桂、石塚真由美
  • Organizer: 第159回日本獣医学会学術集会
  • Place of Presentation: 日本大学生物資源科学部、藤沢市、神奈川県
  • Year and Date: 2016-09-06 – 2016-09-08
• [Presentation] 犬と猫の慢性腎臓病における尿細管周囲毛細血管の変化 (2016)
  • Author(s): 中村麗菜、矢吹 映、市居 修、水川葉月、横山 望、大和 修
  • Organizer: 第159回日本獣医学会学術集会
  • Place of Presentation: 日本大学生物資源科学部、藤沢市、神奈川県
  • Year and Date: 2016-09-06 – 2016-09-08
• [Presentation] Metabolic capacities of polychlorinated biphenyls (PCBs) in cats and dogs (2016)
  • Author(s): Hazuki Mizukawa, Kei Nomiyama, Shinsuke Tanabe, Misaki Maehara, Nozomu Yokoyama,Osamu Ichii, Mitsuyoshi Takiguchi, Yoshinori Ikenaka, Shouta M.M. Nakayama, Mayumi Ishizuka
  • Organizer: 8th International Toxicology Symposium in Africa
  • Place of Presentation: Giza, Egypt
  • Year and Date: 2016-08-29 – 2016-08-31
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] クロスオミックスによるイヌ脳の PCBs 毒性評価（Cross omics analysis for PCBs toxicity in the dog brain） (2016)
  • Author(s): 髙口倖暉、野見山桂、Lauan Maria Claret、Yoo Jean、水川葉月、岩田久人、国末達也、田辺信介
  • Organizer: 日本プロテオーム学会2016年大会
  • Place of Presentation: 北里大学、東京都港区
  • Year and Date: 2016-07-28 – 2016-07-29
• [Presentation] ハリネズミは化学物質高感受性種？ African hedgehog (Atalerix albiventris)で観察された低薬物代謝能 (2016)
  • Author(s): アクソルン サエンティエンチャイ、池中 良徳、ネスタ サム、ウスマ ジャムナーク、水川 葉月、中山 翔太、石塚 真由美
  • Organizer: 第43回日本毒性学会学術年会
  • Place of Presentation: ウインクあいち、名古屋、愛知
  • Year and Date: 2016-06-29 – 2016-07-01
• [Presentation] ポリ塩化ビフェニル（PCBs）のin vivo暴露によるネコの異物代謝解明と甲状腺ホルモンへの影響評価 (2016)
  • Author(s): 水川 葉月、前原 美咲、横山 望、市居 修、滝口 満喜、野見山 桂、西川 博之、池中 良徳、中山 翔太、高口 倖暉、田辺 信介、石塚 真由美
  • Organizer: 第43回日本毒性学会学術年会
  • Place of Presentation: ウインクあいち、名古屋、愛知
  • Year and Date: 2016-06-29 – 2016-07-01
• [Presentation] UGTの動物種差 (2016)
  • Author(s): 石塚 真由美、中山 翔太、水川 葉月、池中 良徳
  • Organizer: 第43回日本毒性学会学術年会
  • Place of Presentation: ウインクあいち、名古屋、愛知
  • Year and Date: 2016-06-29 – 2016-07-01
• [Presentation] ネコにおけるポリ塩化ビフェニル（PCBs）の異物代謝機構解明と甲状腺ホルモンへの影響評価 (2016)
  • Author(s): 水川葉月、前原美咲、横山望、市居修、滝口満喜、野見山桂、西川博之、池中良徳、中山翔太、高口倖暉、田辺信介、石塚真由美
  • Organizer: 第25回環境化学討論会
  • Place of Presentation: 朱鷺メッセ、新潟
  • Year and Date: 2016-06-08 – 2016-06-10
• [Presentation] 有機ハロゲン化合物によるコンパニオンアニマルの汚染実態と甲状腺ホルモンへの影響評価 (2016)
  • Author(s): 野見山 桂、山本 恭央、水川 葉月、江口 哲史、滝口 満喜、中山 翔太、池中 良徳、石塚 真由美、国末 達也、田辺 信介
  • Organizer: 第25回環境化学討論会
  • Place of Presentation: 朱鷺メッセ、新潟
  • Year and Date: 2016-06-08 – 2016-06-10
• [Presentation] メタボローム解析を用いたPCBsによるイエネコの毒性影響評価 (2016)
  • Author(s): 西川博之、野見山桂、水川葉月、横山望、市居修、滝口満喜、石塚真由美、池中良徳、中山翔太、江口哲史、国末達也、田辺信介
  • Organizer: 第25回環境化学討論会
  • Place of Presentation: 朱鷺メッセ、新潟
  • Year and Date: 2016-06-08 – 2016-06-10
• [Presentation] クロスオミックスによるイヌ脳へのPCBs毒性評価：ミトコンドリア機能へ及ぼす影響解析 (2016)
  • Author(s): 高口 倖暉、野見山 桂、Lauan Maria Claret、草木 桃子、Yoo Jean、水川 葉月、岩田 久人、国末 達也、田辺 信介
  • Organizer: 第25回環境化学討論会
  • Place of Presentation: 朱鷺メッセ、新潟
  • Year and Date: 2016-06-08 – 2016-06-10
• [Presentation] メタボロミクスアプローチを用いたイヌ脳へのOH-PCBs毒性機序の解明 (2016)
  • Author(s): 野見山 桂、高口 倖暉、江口 哲史、水川 葉月、Yoo Jean、田村 沙弥、忍穂井 智子、岩田 久人、国末 達也、田辺 信介
  • Organizer: 第25回環境化学討論会
  • Place of Presentation: 朱鷺メッセ、新潟
  • Year and Date: 2016-06-08 – 2016-06-10
• [Remarks] 北海道大学大学院獣医学研究院毒性学教室HP
  • URL: http://tox.vetmed.hokudai.ac.jp/
• [Remarks] 北海道大学大学院獣医学研究院毒性学教室Facebook
  • URL: https://www.facebook.com/tox.vetmed.hokudai/