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2015 Fiscal Year Research-status Report

コンパートメント境界の維持に必要な細胞間認識メカニズムの解明

Research Project

Project/Area Number 15K18536
Research InstitutionInstitute of Physical and Chemical Research

Principal Investigator

梅津 大輝  国立研究開発法人理化学研究所, 多細胞システム形成研究センター, 研究員 (60620474)

Project Period (FY) 2015-04-01 – 2017-03-31
Keywordsコンパートメント境界 / 細胞の選り分け / 細胞間認識 / トランスクリプトーム解析
Outline of Annual Research Achievements

組織を区画化することは多細胞生物の発生に共通の原理である。発生過程において、一つの組織内においても細胞の自由な混ざり合いがある区画内に制限されることがある。このような区画はコンパートメントと呼ばれる。コンパートメント境界を維持するための細胞間のシグナル伝達、物理的特性、細胞動態などが次々と明らかにされてきている一方で、細胞の混ざり合いを防ぐ実行因子は同定されておらず、細胞間の接触面における局所的な相互作用を制御するメカニズムの理解までは至っていない。網羅的遺伝子発現解析、遺伝子工学、生物物理学などを組み合わせ、多角的にアプローチすることで、組織構築の統合的な理解をめざす。ショウジョウバエの翅は翅原基とよばれる上皮組織から生じる。 翅原基は発生を通じて前部(A)/後部(B)コンパートメントに分かれ、コンパートメント境界はまっすぐに維持される。本年度は、細胞によるコンパートメント境界の認識に関わる候補遺伝子の探索を試みた。トランスクリプトーム解析による網羅的解析に加え、機能的に関連が高いと見られる分子に的を絞って解析を行った。トランスクリプトーム解析においては、A及びP細胞間で発現に差異が見られる遺伝子の同定をめざした。発現量の違いが認められたものの中から、細胞間認識に関わりうるドメインを持つ23遺伝子を選定した。また、細胞間の認識に関わることが近年示唆されたToll遺伝子ファミリーからは、発現量の解析に基づいて4遺伝子を選定し、機能解析を進めた。その結果、Tollファミリーの4遺伝子の発現量の違いによって細胞が選り分けられることが明らかとなった。さらに、Toll-1のレポーター遺伝子の発現パターンはこの遺伝子がコンパートメント境界の維持に関わることを強く示唆していたことから、今後はToll遺伝子を中心に解析を進めることにしている。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

コンパートメント境界を維持する分子メカニズムを明らかにすることをめざし、トランスクリプトーム解析による網羅的解析に加え、機能的に関連が高いと見られる分子に的を絞って関連する遺伝子の探索を行った。トランスクリプトーム解析においては、A及びPコンパートメントに由来する細胞間で発現に差異が見られる遺伝子の同定をめざした。P細胞特異的に蛍光タンパク質Venusを発現するコンストラクトを用い、翅原基から蛍光フローサイトメトリーでVenus陽性と陰性の細胞を分取した。続いて、それぞれの細胞集団から全RNAを抽出しRNA-seqを行った。得られた膨大なデータから異種細胞間の認識に関わる候補分子を選定するため、バイオインフォマティクスによる解析を行った。A、P細胞間で発現量に大きな差異が認められたものの中から、細胞間の認識に関わることが知られる、LRR、Ig、FN III、カドヘリンリピートのドメインのいずれかを有する分子を網羅的に探索し、23遺伝子を選定した。また、細胞間の認識に関わることが近年示唆されたToll遺伝子群に注目し、翅原基において発現量が高かったToll-1、Toll-2、Toll-7、Toll-8の4遺伝子を候補として絞った。候補遺伝子を過剰発現する体細胞クローンをモザイク状に誘導し、クローンが円滑な形態を示すことを細胞の選り分けの指標にして解析を行った。その結果、Toll遺伝子群の4遺伝子が細胞の選り分けの表現型を示した。これらの遺伝子の発現レベルの違いによって細胞が選り分けられうることが示された。さらに、 レポーター遺伝子の解析から、Toll-1がコンパートメント境界を境とした興味深い発現パターンを示すことが明らかになった。Toll遺伝子群が細胞の選り分けや組織境界の維持に関わるという報告は前例がなく、新規の分子メカニズムの解明につながることが期待される。

Strategy for Future Research Activity

Toll遺伝子ファミリーのうち翅原基で発現量が多かった遺伝子、Toll-1、Toll-2、Toll-7、Toll-8の4遺伝子は、いずれも発現量の違いによって細胞の選り分けを引き起こすことが明らかになった。今後は、これらの遺伝子がコンパートメント境界における細胞間の認識機構に関わるかどうかを解析し、境界維持の分子メカニズムを明らかにする。Toll-1のレポーター遺伝子の発現パターンはこの遺伝子がコンパートメント境界の維持に関わることを強く示唆するものであった。そこで、上記の4遺伝子について、CRISPRによるゲノム編集技術によってVenusノックイン系統を作製し、それぞれの遺伝子の発現パターンと細胞内局在を明らかにすることをめざす。また、これらの遺伝子を過剰発現、又はRNAiによって機能阻害し、コンパートメント境界の形態に異常が生じるかどうかを解析する。これら4遺伝子が重複した機能を持つことも考えられることから、それぞれ単独のRNAi等で表現型が見られない時には、複数遺伝子を同時にノックダウンするコンストラクトを作製し、表現型を解析する。さらに、Venusのノックイン系統の生組織を用いてライブイメージングを行い、これらの分子が細胞内でどのような局在パターンと動態を示すかを明らかにする。得られた結果から相互作用しうる分子を推察し、遺伝学を用いて相互依存性を解析することや、培養細胞に遺伝子を発現させて細胞間の接着性への影響を検証するなど力学的な視点から解析を行う。以上のような多角的なアプローチを組み合わせて、コンパートメント境界における細胞間の認識と細胞の選り分けに関わるToll遺伝子群の分子機能を明らかにする。

Causes of Carryover

次年度では、当初想定していたものよりも多くの遺伝子組換え体の作製が必要となることから、費用確保の必要性が生じた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

遺伝子組換えショウジョウバエの作製にかかるインジェクションサービス委託費用に利用する計画である。

  • Research Products

    (7 results)

All 2016 2015 Other

All Int'l Joint Research (1 results) Journal Article (1 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Peer Reviewed: 1 results) Presentation (5 results) (of which Int'l Joint Research: 3 results,  Invited: 1 results)

  • [Int'l Joint Research] Technische Universitat Dresden/Institute of Genetics(Germany)

    • Country Name
      Germany
    • Counterpart Institution
      Technische Universitat Dresden/Institute of Genetics
  • [Journal Article] A local difference in Hedgehog signal transduction increases mechanical cell bond tension and biases cell intercalations along the Drosophila anteroposterior compartment boundary2015

    • Author(s)
      Rudolf, K., Umetsu, D., Aliee, M., Sui, L., Julicher, F. and Dahmann, C
    • Journal Title

      Development

      Volume: 142 Pages: 3845-3858

    • DOI

      10.1242/dev.125542

    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
  • [Presentation] PTP61Fの制御機構が細胞競合と細胞増殖の力学的制御のつながりを示唆する2016

    • Author(s)
      梅津大輝、倉永英里奈
    • Organizer
      第五回 細胞競合コロキウム
    • Place of Presentation
      北海道大学遺伝子病制御研究所 (北海道 札幌市)
    • Year and Date
      2016-03-17 – 2016-03-18
  • [Presentation] Identification of mechanisms that protect cells from cell competition at anteroposterior compartment boundary in developing Drosophila wings2015

    • Author(s)
      Umetsu, D. and Kuranaga, E.
    • Organizer
      1st International Symposium on Cell Competition
    • Place of Presentation
      京都大学 (京都府 京都市)
    • Year and Date
      2015-09-10 – 2015-09-10
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Tissue proliferation control by mechanical stresses2015

    • Author(s)
      Umetsu, D. and Kuranaga, E.
    • Organizer
      The 26th CDB Meeting, Mechanistic Perspectives of Multicellular Organization
    • Place of Presentation
      理化学研究所多細胞システム形成研究センター (兵庫県 神戸市)
    • Year and Date
      2015-09-08 – 2015-09-09
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] 機械的ストレス応答による組織増殖の制御機構2015

    • Author(s)
      梅津大輝、倉永英里奈
    • Organizer
      第27回 高遠・分子細胞生物学シンポジウム
    • Place of Presentation
      延暦寺会館 (滋賀県 大津市)
    • Year and Date
      2015-08-26 – 2015-08-27
  • [Presentation] Local increases in mechanical tension guide cell sorting along compartment boundaries by biasing cell intercalations2015

    • Author(s)
      Daiki Umetsu
    • Organizer
      48th Annual Meeting of the Japanese Society of Developmental Biologists
    • Place of Presentation
      つくば国際会議場 (茨城県 つくば市)
    • Year and Date
      2015-06-02 – 2015-06-05
    • Int'l Joint Research / Invited

URL: 

Published: 2017-01-06  

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