2015 Fiscal Year Research-status Report
質量分析計を基盤技術とした高感度スフィンゴ脂質分析法の開発と組織分布解析への応用
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15K18842
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
三枝 大輔 東北大学, 東北メディカル・メガバンク機構, 講師 (90545237)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | スフィンゴ脂質 / レーザーマイクロダイセクション / LC-MS/MS / ヒートスタビライザー / IMS |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、LC-MS/MS 及び IMS を分析基盤技術として用いる一細胞スフィンゴ脂質評価系を開発し、微量組織切片中スフィンゴ脂質の含有量、細胞間濃度勾配及び分布局在を明らかにすることである。また、スフィンゴ脂質代謝関連分子の発現量との分布相関を分子マッピングにて解析し、脂質メディエーターとしての作用を明らかにすることである。
平成２７年度は、LC-MS/MS による精密定量分析法の超高感度化を実施し、レーザーマイクロダイセクション (LMD) により切り出された組織切片に含有されるスフィンゴ脂質をヒートスタビライザーの条件を最適化することにより高い再現性で測定可能にすることに加え、IMS によるスフィンゴ脂質の相関分布解析法を構築することが目的であった。
現在までに、LMDで切り出された微量組織切片中に含まれるスフィンゴ脂質を高い再現性で安定して定量することに成功した。また、IMSを用いるスフィンゴ脂質測定では、MALDIに用いるマトリックスの選択と塗布方法の検討により、一部のスフィンゴ脂質を除き、脾臓のイメージング画像を取得することに成功した。さらに、脾臓の連続切片による、H&E染色、LMD切片のLC-MS/MS測定及びIMS測定を実施したところ、赤脾髄及び白脾髄に含有されるスフィンゴ脂質分布の違いを明らかにすることに成功した。
平成２８年度は、より高感度且つ高精度なスフィンゴ脂質のイメージング画像を得ると共に、組織切片におけるSK、S1PR、Spns及びApoMの発現量を測定し、スフィンゴ脂質含有量の濃度勾配、分布局在との相関解析を実施する。また、これら分子の阻害剤投与若しくは発現遺伝子欠損マウスを用い、スフィンゴ脂質代謝系の変化を解析し、脂質メディエーター機能を明らかにする予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
初めに、組織切片に含まれるスフィンゴ脂質を、高い再現性にて安定して測定することを目的とし、ヒートスタビライザーを用いた。ヒートスタビライザーは、通常95℃、1 分間の加熱処理により酵素を失活させることで、代謝物の分解を抑制するが、高温で処理されるため、組織に萎縮がみられ、LMDによる正確な定量や、イメージングMSによる分布解析に適さない状態になる。そこで、初めに脾臓におけるヒートスタビライザーの温度及び時間の最適化を実施した結果、65℃で30秒間処理した時に、組織の萎縮なく且つスフィンゴ脂質の分解を抑制することが示された。また、最適化した条件を用い、マウスの脾臓組織から連続切片を作成し、染色、LC-MS/MS及びIMS解析を実施したところ、一部のスフィンゴ脂質（スフィンゴシン等）は、赤脾髄及び白脾髄における定量値とイメージング画像の相関が観察された。以上の点は、概ね順調に進捗していると考えられる。
一方、本研究に用いたIMSは、質量分解能及び感度が低いことから、組織含有濃度が低いと想定された一部のスフィンゴ脂質は、明確なイメージ画像が得られなかった。現在、高分解能を有するIMSを用いた脾臓におけるスフフィンゴ脂質のイメージング測定を実施している。また、10細胞程度の組織切片からのスフィンゴ脂質の定量は、現在までに成功しておらず、nanoLCを組み合わせる等、さらなるLC-MS/MSの高感度化が必要と考えられる。
以上の成果から、目標とした1～10細胞に含まれるスフィンゴ脂質の定量に課題があると共に、IMS測定においても、より高感度な測定を実施する必要があると想定され、実際よりも研究が遅れていると判断している。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成２８年度は、初めにイメージングMS測定の高感度化を目的とし、MALDIにFourier transform (FT) MSを組み合わせた装置もしくはdesorption electrospray ionization mass spectrometry, DESI-MSにイオンモビリティを搭載した装置を用いた組織切片に含有されるスフィンゴ脂質の解析を実施する。また、イメージングMSの感度向上は、現在最も課題になっていることから、専門家の指導を積極的に受けて研究を進める。また、LC-MS/MSの超高感度化測定法の構築は、初めにnanoLCを使用した測定手法を構築し、微量組織切片（10細胞程度）に含有されるスフィンゴ脂質の定量を試みる。また同時に、原子間力顕微鏡（AFM）を用い、分析カラムの球状シリカへのスフィンゴ脂質の結合状態をリアルタイム分析し、ODSへの保持及び抽出条件を最適化することで、多方面からスフィンゴ脂質の高感度測定条件を検討する予定である。
次に、マウス組織切片を用い、SK、S1PR、Spns及びApoMを、組織免疫染色抗体を用いて染色し、同時に作成した連続組織切片を、平成２７年度に開発したLC-MS/MS及びIMSによる分析法で測定する。得られたMS測定の結果は、染色画像と重ね合わせ、スフィンゴ脂質の分布局在の相関性を解析する。また、SK、S1PR、Spns及びApoMの阻害剤投与若しくは発現遺伝子欠損マウスを用い、スフィンゴ脂質代謝系の変化を解析し、脂質メディエーター機能を明らかにする予定である。
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[Journal Article] Increased mRNA Levels of Sphingosine Kinases and S1P Lyase and Reduced Level of S1P were Observed in Hepatocellular Carcinoma in Association with Poorer Differentiation and Earlier Recurrence2016
Author(s)
Uranbileg B, Ikeda H, Kurano M, Enooku K, Sato M, Saigusa D, Aoki J, Ishizawa T, Hasegawa K, Kokudo N, Yatomi Y.
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Journal Title
PLOS ONE
Volume: 11(2)
Pages: e0149462
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Mitochonic Acid 5 (MA-5), a Derivative of the Plant Hormone Indole-3-Acetic Acid, Improves Survival of Fibroblasts from Patients with Mitochondrial Diseases2015
Author(s)
Suzuki T, Yamaguchi H, Kikusato M, Matsuhashi T, Matsuo A, Sato T, Ohba Y, Watanabe S, Minaki D, Saigusa D, Shimbo H, Mori N, Mishima E, Shima H, Akiyama Y, Takeuchi Y, Yuri A, Kikuchi K, Toyohara T, Suzuki C, Kohzuki M, Anzai J, Mano N, Kure S, Yanagisawa T, Tomioka Y, Toyomizu M, Ito S, Osaka H, Hayashi K, Abe T
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Journal Title
Tohoku J. Exp. Med.
Volume: 236(3)
Pages: 225-232
DOI
Peer Reviewed
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[Presentation] Development of Protocol for Global Metabolomics in Clinical and Cohort Study by LC-MS2015
Author(s)
Daisuke Saigusa, Junichi Sugawara, Mitsuyo Matsumoto, Yasutake Katoh, Ryu Yamashita, Yasuhiro Kurosawa, Jun Yasuda, Masayuki Yamamoto, Osamu Tanabe
Organizer
Metabolomics 2015
Place of Presentation
San Diego, CA, USA
Year and Date
2015-06-28 – 2015-07-03
Int'l Joint Research
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[Presentation] Global Metabolomic Analysis by UPLC-TOF-MS for Identification of Predictive and Prognostic Biomarkers for Obstetric Complications2015
Author(s)
Daisuke Saigusa, Junichi Sugawara, Mitsuyo Matsumoto, Yasutake Katoh, Ryu Yamashita, Yasuhiro Kurosawa, Jun Yasuda, Osamu Tanabe, Masayuki Yamamoto
Organizer
8th International DIP Symposium on Diabetes, Hypertension, Metabolic Syndrome & Pregnancy
Place of Presentation
Berlin, Germany
Year and Date
2015-04-15 – 2015-04-17
Int'l Joint Research
