2015 Fiscal Year Research-status Report
腸上皮インテグリンによる菌由来物質認識機構を介した新規宿主‐細菌相互作用の解明
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15K19307
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| Research Institution | Asahikawa Medical College |
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Principal Investigator |
田中 一之 旭川医科大学, 大学病院, 医員 (30624176)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | エンドサイトーシス / ポリリン酸 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々の研究室では，麦芽乳酸菌から分泌されるポリリン酸が腸管上皮障害を改善させることを突きとめた．その後，ポリリン酸が腸管上皮integrin β1に認識された後にcaveolin-1依存性エンドサイトーシスを介して細胞内に取り込まれることを見出した．そこで，ポリリン酸が腸管上皮細胞に取り込まれた後の動態および作用機序について明らかにすることを目的に検討を行った．
32P標識ポリリン酸を作製，Caco2/bbe細胞株へ投与したところ，1時間後に細胞内へ取り込まれ，その後時間経過とともに細胞外へ移行した．蛍光免疫染色でも同様に細胞内外の移動を認めた．また，caveolin-1発現抑制Caco2/bbe細胞株を作製し検討をしたところ，ポリリン酸の細胞内取り込みはcaveolin-1発現抑制により有意に減少した．Western blotting（細胞保護蛋白Hsp27およびリン酸化p38 MAPKの発現評価）およびマンニトール漏出試験により，ポリリン酸の細胞保護作用がcaveolin-1発現抑制にて抑制されることが確認された．以上より，ポリリン酸はcaveolin-1依存性エンドサイトーシスを介して作用を発揮することが示された．
high-throughput sequencing解析にてポリリン酸投与で発現量が変化したmRNAを抽出し，バリア機能増強作用に関連するtumor necrosis factor alpha-induced protein 3(TNFAIP3)を候補分子として同定した．TNFAIP3の発現誘導はcaveolin-1発現抑制により減弱した．TNFAIP3はTNFα/NF-κBシグナルを強力に抑制すること，腸管バリア機能を増強することが知られており，ポリリン酸がTNFAIP3の発現誘導を介して腸管バリア機能の回復などの有益な作用を発揮していることが示唆された．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成27年度に実施した研究成果（研究実績の概要の欄に記載）については英文論文として公表し，広く社会に発信した．
腸管上皮にエンドサイトーシスを介して取り込まれるポリリン酸以外の腸内細菌由来活性物質の同定については今後の研究課題である．
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| Strategy for Future Research Activity |
1. 腸管上皮におけるポリリン酸の作用の同定
TNFAIP3をsiRNAを用いて特異的に抑制した腸管上皮細胞株を作製し，ポリリン酸の作用が抑制されることを確認する．ポリリン酸投与時のlipopolysaccharide（LPS）やLipoteichoic acid（LTA）に対する反応性の変化を炎症性サイトカインの発現量変化を指標に評価を行う．また，マウス腸管上皮TNFAIP3発現抑制モデルを用いてポリリン酸を投与し，マンニトール漏出試験で腸管バリア機能を検討し，ポリリン酸の生理活性の変化を明らかにする．
2. 腸管上皮にエンドサイトーシスを介して取り込まれる腸内細菌由来活性物質の同定と作用解析
各種腸内細菌の培養上清を回収し，各種カラムを用いてインテグリンを誘導する分画を分離・精製する．これを繰り返し，HPLCにて単一のピークになった活性分画を回収し，質量分析器を用いてポリリン酸以外の菌由来活性物質を同定する．同定した腸内細菌由来活性物質を腸上皮細胞に添加し，細胞増殖能，アポトーシス刺激や炎症刺激に対する反応性の変化を検討する．
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| Causes of Carryover |
研究成果発表のために設定していた旅費を使用しなかったため．
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
研究成果発表のため，旅費として使用する．
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