宿主細胞のオートファジーに着目したインフルエンザ関連肺炎の重症化メカニズム解明

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K19587
• Research Institution: Nagasaki University
• Principal Investigator: 小佐井 康介 長崎大学, 病院(医学系), 助教 (70644433)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: インフルエンザウイルス / 肺炎球菌 / オートファジー阻害薬

Outline of Annual Research Achievements

本研究ではインフルエンザウイルスと肺炎球菌が重複感染した際にみられる過剰な免疫応答をオートファジーに着目して解析する。それにより重症化に関与するオートファジー関連因子を同定すること、また、その因子に介入することによって過剰な炎症を抑制するための新たな治療戦略を考案することを目的としている。これまでの検討では、A549細胞を用いたインフルエンザウイルスと肺炎球菌の重複感染モデルにおけるオートファジー阻害薬の作用として、炎症性サイトカインの産生低下や肺炎球菌の接着・侵入の抑制を認めていた。更にマイクロアレイを用いて遺伝子発現の変化を比較したところ、蛋白レベルでの解析と同様に炎症性サイトカインの遺伝子の発現低下を認めた。また、逆にオートファジー阻害薬を作用させた場合に、マイクロアレイにおいて発現が増加したプロテアーゼの遺伝子について蛋白レベルで解析を実施した。そのプロテアーゼは、感染していないA549細胞にオートファジー阻害薬を作用させた場合においても蛋白レベルでの発現が増加していた。そのため現時点ではこのプロテアーゼの病態への関与や意義は不明であるが、今後も検討を継続する。細胞レベルでの検討に加えてin vivoにおける実験も開始している。具体的には、マウスを用いて重複感染モデルを作成し、単独感染と重複感染のそれぞれにおいて肺組織を採取した。現在、肺組織におけるオートファジー関連因子の発現について解析を進めている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

A549細胞を用いたインフルエンザウイルスと肺炎球菌の重複感染モデルにおける検討により細胞レベルにおいて解析が進んでいる。また、マウスモデルを用いた実験も開始しており概ね順調に進展していると思われる。しかし、各結果の再現性の確認が十分でなく、今後の課題である。

Strategy for Future Research Activity

これまで得られたin vitroにおける結果を元に、インフルエンザウイルスと肺炎球菌の重複感染マウスモデルを用いて実験を進める。具体的には、それぞれ病原体の単独感染群と重複感染群から採取した肺組織において、組織学的にオートファジー関連因子であるLC3Bの発現を比較する。また、p62など関連因子の測定を行い、定量的に比較する。
更に、オートファジーの役割を明らかにするため、重複感染マウスにオートファジー阻害薬を作用させた上で、オートファジー関連因子の発現や炎症性サイトカインの発現の変化を解析する。また、肺内のウイルスや肺炎球菌の量を定量し、それらのクリアランスに与える影響を評価する。
In vitroにおけるマイクロアレイの結果、特に顕著に変動した遺伝子について、重複感染マウスにおける発現を薬剤投与群と非投与群で比較する。

Causes of Carryover

購入を検討している試薬の価格が、次年度使用額（本年度未使用額）より大きかったため、来年度に繰り越して購入する予定とした。

Expenditure Plan for Carryover Budget

感染モデルに使用するマウス、ウイルス・細菌の培養に必要な試薬、宿主の免疫応答の解析に使用する抗体、オートファジー関連因子の検出やその阻害に使用する試薬、情報収集や研究成果を発表するための旅費などに使用する予定である。

Research Products

• [Journal Article] Premedication with clarithromycin is effective against secondary bacterial pneumonia during influenza virus infection in a pulmonary emphysema mouse model. (2016)
  • Author(s): Tatsuhiko Harada, Yuji Ishimatsu, Atsuko Hara, Towako Morita, Shota Nakashima, Tomoyuki Kakugawa, Noriho Sakamoto, Kosuke Kosai, Koichi Izumikawa, Katsunori Yanagihara, Hiroshi Mukae, and Shigeru Kohno
  • Journal Title: Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics Volume: 358 Pages: 457-63
  • DOI: 10.1124/jpet.116.233932.
  • Peer Reviewed