2016 Fiscal Year Annual Research Report
Genome editing and cancer modeling for head and neck cancer using CRISPR/Cas system
Project/Area Number |
15K20203
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Research Institution | Osaka University |
Principal Investigator |
チョウ 弘規 大阪大学, 医学部附属病院, 医員 (40648812)
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Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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Keywords | CRISPR/Cas |
Outline of Annual Research Achievements |
本研究では「CRISPR/Cas」システムを用いて、①頭頸部扁平上皮がん細胞のゲノム改変を行い、その発癌過程における遺伝子変異の役割を解明すること、②また、正常頭頸部扁平上皮細胞を採取し、そのゲノムにCRISPR/Casをもちいて基地の頭頸部癌遺伝子異常部位を導入することにより頭頸部の発癌モデルが可能かどうか検討することの2つを目的としている。 27年度・28年度研究計画では、頭頸部扁平上皮がん細胞株でのCRISPR/Casを用いたノックアウト・ノックイン細胞の作製を計画し、ノックアウト細胞についてDet562,Fadu,UMSCC47の3種類の細胞で樹立した。これらは当初の予定通り、ターゲット部位特異的gRNAとCas9を共導入することによって行った。p53,PIK3Caについてノックアウトを行い、シークエンスによって破壊を確認した。表現型解析は増殖アッセイ・細胞周期アッセイを行い、目的の遺伝子がdysfunctionすることによる細胞挙動の変化を確認した。UMSCC47については、当初の遺伝子に加えてE6,E7をノックアウトすることに成功した。UMSCC47においても上記と同様に増殖アッセイ・細胞周期アッセイ・ウエスタンブロッティングなどによって標的遺伝子がノックアウトされていることを確認した。 ノックインについて、PIK3CAが致死的な遺伝子であり、シングルセル化の困難さから樹立に難渋した。HPV陽性扁平上皮細胞において、CRISPR/CasをもちいてE6E7をノックインすることで上記②の目標を達成できると考えられる。
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