活性イオウ分子種と8-ニトロ-cGMPによる新規酸化ストレス応答機構

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K20876
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 井田 智章 東北大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (70570406)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 活性イオウ分子種 / 活性システインパースルフィド / 8-ニトロ-cGMP / ポリスルフィド / 酸化ストレス

Outline of Annual Research Achievements

活性酸素と一酸化窒素により生成するニトロ化環状ヌクレオチド 8-ニトロ-cGMPは、酸化ストレス制御シグナル分子として機能している。最近、研究代表者らは活性イオウ分子種（活性システイン(Cys)ポリスルフィド）が8-ニトロ-cGMPを8-SH-cGMPに代謝することでシグナル機能を制御することを見いだした。本研究では、Cysポリスルフィドの高精度定量解析法を構築し、酸化ストレス条件下における活性Cysポリスルフィドと8-ニトロ-cGMPの細胞動態解析、細胞機能解析を行うことにより、両者のクロストークを介した新規酸化ストレス応答の分子メカニズムを明らかにすることを目指した。
本年度は、生体内Cysポリスルフィドの質量分析装置(LC-MS/MS)を用いた高精度な定量解析を行うため、従来のmonobromobimaneの代わりに、ヨードアセトアミド誘導体をCysポリスルフィド捕捉剤として用いる新規Cysポリスルフィド高感度定量解析システムを構築することに成功した。さらに蛍光標識ヨードアセトアミド誘導体を用いることで、より簡便にCysポリスルフィドを定量的に解析するHPLC-蛍光検出法を構築した。LC-MS/MSによる解析系を用いて、活性Cysポリスルフィド生成酵素であるシスタチオニン γ-リアーゼ（CSE）による活性Cysポリスルフィド生成について、酵素速度論的解析を行った。その結果、CSEは高いCysポリスルフィド生成能を有することが示された。さらに、活性Cysポリスルフィド特異的蛍光プローブ（SSP4）を用いたイメージング解析を行い、活性Cysポリスルフィドの細胞内局在についてのイメージング解析に成功した。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

本年度は当初の研究計画通りに、従来の活性イオウ分子種定量的解析法と比較して、さらに特異性や定量性を改良した新たな解析系を構築し、in vitro, in vivoにおける活性Cysポリスルフィド生成レベルの定量的解析に成功した。
さらに、当初の計画では平成２８年度に計画していたタンパク質システイン残基のポリサルファ化レベル解析を新規活性Cysポリスルフィド定量解析法を用いて、解析することに成功した。また活性Cysポリスルフィド生成機構をより詳細に解析する中で、これまでに報告のない新たな活性Cysポリスルフィド生成酵素を発見した。

Strategy for Future Research Activity

当初の研究計画に従い、生体内8-ニトロ-cGMPと8-SH-cGMPのレベルについて、LC-MS/MSを用いた定量的解析方法を用いて測定し、活性Cysポリスルフィドと8-ニトロ-cGMPの各細胞内レベルの相関を明らかにする。さらに、これらの細胞・組織中の８-ニトロ-cGMPシグナルの指標として、レドックス感受性転写調節因子Keap1のS-グアニル化をウエスタンブロットにより解析し、酸化ストレスによる生体内活性Cysポリスルフィドレベルの変動とタンパク質S-グアニル化によるシグナル伝達との関連を明らかにする。一方、タンパク質Cysポリスルフィド化レベルの定量的解析とポリサルファ化システイン残基の同定について解析を進め、タンパク質Cysポリスルフィド化とS-グアニル化、さらにポリS-グアニル化との相関関係を解明する。

Causes of Carryover

本年度は、実験に使用する試薬、消耗品などの物品費が当初の予定よりも少ない額で目標を達成することができたため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

生体内8-ニトロ-cGMPと8-SH-cGMPのレベルについて、LC-MS/MSを用いた定量的解析やタンパク質S-グアニル化によるシグナル伝達との関連を明らかにする為の実験に関する試薬や消耗品などの物品費に使用する。また、研究成果を論文にまとめ投稿する為の英文校正や論文投稿費として使用する。

Research Products

• [Journal Article] Redox signaling regulated by an electrophilic cyclic nucleotide and reactive cysteine persulfides (2016)
  • Author(s): Fujii Shigemoto, Sawa Tomohiro, Nishida Motohiro, Ihara Hideshi, Ida Tomoaki, Motohashi Hozumi, Akaike Takaaki
  • Journal Title: Archives of Biochemistry and Biophysics Volume: 595 Pages: 140-146
  • DOI: 10.1016/j.abb.2015.11.008
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Persistent activation of cGMP-dependent protein kinase by a nitrated cyclic nucleotide via site specific protein S-guanylation (2016)
  • Author(s): Akashi S, Ahmed KA, Sawa T, Ono K, Tsutsuki H, Burgoyne JR, Ida T, Horio E, Prysyazhna O, Oike Y, Rahaman MM, Eaton P, Fujii S, Akaike T
  • Journal Title: Biochemistry Volume: 55 Pages: 751-761
  • DOI: 10.1021/acs.biochem.5b00774
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] 活性イオウ含有分子の再発見とその生物活性 (2016)
  • Author(s): 井田智章、松永哲郎、藤井重元、澤 智裕、赤池孝章
  • Journal Title: 日本薬理学雑誌 Volume: 147 Pages: in press
• [Journal Article] Thiosulfate mediates cytoprotective effects of hydrogen sulfide against neuronal ischemia (2015)
  • Author(s): Marutani E, Yamada M, Ida T, Tokuda K, Ikeda K, Kai S, Shirozu K, Hayashida K, Kosugi S, Hanaoka K, Kaneki M, Akaike T, Ichinose F
  • Journal Title: J Am Heart Assoc Volume: 4 Pages: e002125
  • DOI: 10.1161/JAHA.115.002125
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] 8-Nitro-cGMP enhances SNARE complex formation through S-guanylation of Cys90 in SNAP25 (2015)
  • Author(s): Kunieda K, Tsutsuki H, Ida T, Kishimoto Y, Kasamatsu S, Sawa T, Goshima N, Itakura M, Takahashi M, Akaike T, Ihara H
  • Journal Title: ACS Chem Neurosci Volume: 6 Pages: 1715-1725
  • DOI: 10.1021/acschemneuro.5b00196
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Hyperhomocysteinemia abrogates fasting-induced cardioprotection against ischemia/reperfusion by limiting bioavailability of hydrogen sulfide anions (2015)
  • Author(s): Nakano S, Ishii I, Shinmura K, Tamaki K, Hishiki T, Akahoshi N, Ida T, Nakanishi T, Kamata S, Kumagai Y, Akaike T, Fukuda K, Sano M, Suematsu M
  • Journal Title: J Mol Med (Berl) Volume: 93 Pages: 879-889
  • DOI: 10.1007/s00109-015-1271-5
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Reactive sulfur species-mediated activation of the Keap1-Nrf2 pathway by 1,2-napthoquinone through sulfenic acids formation under oxidative stress (2015)
  • Author(s): Shinkai Y, Abiko Y, Ida T, Miura T, Kakehashi H, Ishii I, Nishida M, Sawa T, Akaike T, Kumagai Y
  • Journal Title: Chem Res Toxicol Volume: 28 Pages: 838-847
  • DOI: 10.1021/tx500416y
• [Journal Article] Water-soluble ferulic acid derivatives improve amyloid-β-induced neuronal cell death and dysmnesia through inhibition of amyloid-β aggregation (2015)
  • Author(s): Kikugawa M, Tsutsuki H, Ida T, Nakajima H, Ihara H, Sakamoto T
  • Journal Title: Biosci Biotechnol Biochem Volume: 80 Pages: 547-553
  • DOI: 10.1080/09168451.2015.1107463
• [Journal Article] RSSによる抗酸化・レドックスシグナル制御 (2015)
  • Author(s): 井田智章、藤井重元、赤池孝章
  • Journal Title: 細胞工学 Volume: 34 Pages: 354-357
• [Journal Article] 活性イオウ分子による酸化・ニトロ化ストレス制御 (2015)
  • Author(s): 笠松真吾、井田智章、藤井重元、赤池孝章
  • Journal Title: Respiratory Medical Research Volume: 3 Pages: 70-75
• [Presentation] 細菌の新しいシグナル伝達物質：8-ニトロ-cGMPの生成と機能解析 (2016)
  • Author(s): 井田智章、松永哲郎、赤司壮一郎、ジョンミンギョン、津々木博康、藤井重元、居原 秀、澤 智裕、赤池孝章
  • Organizer: 第89回日本細菌学会総会
  • Place of Presentation: 大阪国際交流センター（大阪市天王寺区）
  • Year and Date: 2016-03-23 – 2016-03-25
• [Presentation] Development of metabolome analysis for reactive sulfur species (2016)
  • Author(s): Tomoaki Ida, Shingo Kasamatsu, Shigemoto Fujii, Hideshi Ihara, Tomohiro Sawa, Takaaki Akaike
  • Organizer: The 2016 Oxygen Radicals Gordon Research Conference.
  • Place of Presentation: Ventura Beach Marriott（Ventura, CA, USA）
  • Year and Date: 2016-02-07 – 2016-02-12
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] タンパク質ポリサルファ化の分子メカニズムの解明 (2015)
  • Author(s): 井田智章、居原 秀、魏 研范、富澤一仁、長尾翌手可、鈴木 勉、熊谷嘉人、澤 智裕、笠松真吾、本橋ほづみ、赤池孝章
  • Organizer: 第38回日本分子生物学会年会、第88回日本生化学会大会合同大会
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド（神戸市中央区)
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] 新規レドックス制御機構：活性システインパースルフィドとタンパク質S-ポリチオーレーションによる生体防御 (2015)
  • Author(s): 井田智章、笠松真吾、藤井重元、赤池孝章
  • Organizer: 平成27年度日本薬学会東北支部主催 第14回生物化学若手研究者セミナー
  • Place of Presentation: 東北大学 大学院薬学研究科（仙台市青葉区）
  • Year and Date: 2015-07-25 – 2015-07-25
  • Invited
• [Presentation] 活性システインパースルフィドによる8-ニトロ-cGMP制御機構 (2015)
  • Author(s): 井田智章、居原 秀、澤 智裕、津々木博康、笠松真吾、松永哲郎、赤司壮一郎、 有本博一、藤井重元、赤池孝章
  • Organizer: 第26回日本生体防御学会学術総会
  • Place of Presentation: 台東区生涯学習センター（東京都台東区）
  • Year and Date: 2015-07-10 – 2015-07-12
• [Presentation] 活性システインパースルフィドのメタボロームおよびプロテオーム解析 (2015)
  • Author(s): 井田智章、居原 秀、澤 智裕、土屋幸弘、渡邊泰男、藤井重元、熊谷嘉人、本橋ほづみ、赤池孝章
  • Organizer: 第15回日本NO学会学術集会
  • Place of Presentation: 千里ライフサイエンスセンター（豊中市）
  • Year and Date: 2015-06-26 – 2015-06-27
• [Presentation] 活性システインパースルフィドのメタボロミクスとプロテオミクス (2015)
  • Author(s): 井田智章、居原 秀、澤 智裕、土屋幸弘、渡邊泰男、藤井重元、熊谷嘉人、本橋ほづみ、赤池孝章
  • Organizer: 第68回日本酸化ストレス学会学術集会
  • Place of Presentation: かごしま県民交流センター（鹿児島市）
  • Year and Date: 2015-06-11 – 2015-06-12
• [Remarks] 東北大学大学院医学系研究科環境保健医学分野ホームページ
  • URL: http://www.toxicosci.med.tohoku.ac.jp/index.html