複製終了不全モデルマウスを用いた老化と発がん機構の解析

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K21565
• Research Institution: University of Occupational and Environmental Health, Japan
• Principal Investigator: 香崎 正宙 産業医科大学, 産業生態科学研究所, 助教 (90717977)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 複製 / 細胞周期チェックポイント / 発がん / 老化 / マウスモデル / 抗がん剤耐性 / ノックアウト / p53

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、分子Xが複製終了の制御に関与するという研究代表者らの仮説を元に行った研究で得られた先行的知見を踏まえ、分子Xのノックアウトマウスを複製終了不全モデルマウス実験系として用いて、個体レベルでの発がんや老化における複製終了不全の役割を解析する。まず、分子Xノックアウトマウスの樹立に取り組んだが、C57BL/6系統が遺伝的背景だと胎生致死となる問題に直面した。そこで、計画を変更して戻し交配によってトランスジェニックマウスを得やすいFVB系統へ遺伝的背景を換えることによって、分子X欠損による胎生致死性を回避する作業を行っている。また、発がんや老化研究において、がん抑制遺伝子p53の関与を検証することは不可欠なので、 がん抑制遺伝子p53欠損FVB系統マウスの樹立を並行して行っている。どちらのマウスも現段階でN2世代まで継代しており、FVB系統への戻し交配ができ次第、発がんや老化における分子Xとp53の関係を詳細に解析する。 次に、ヒトでの分子Xの役割を明らかにするために、CRISPR-Cas9技術を用いてヒト細胞での様々な遺伝子破壊株の樹立に取り組んでおり、これまで質量分析法で同定されている分子X相互作用因子群に対するノックアウトコンストラクトを作成した。また、ヒト分子Xノックアウト細胞を樹立し、ニワトリ分子Xノックアウト細胞で既に得られた研究結果と同様の複製終了不全の表現型を確認した。このことにより、少なくとも脊椎動物種間で分子Xの役割が保存されていることが明らかとなった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

平成27年度に、分子Xのノックアウトマウスの樹立を試みたが、目的のC57/BL6系統ノックアウトマウスを得ることが非常に困難であったために、C57/BL6系統の遺伝的背景では胎生致死であると結論付けた。研究協力者らの助言を元に、多産でトランスジェニックマウスを得やすいFVB系統と戻し交配を行うことで(Taketo et al, PNAS, 1991)、分子X欠損による胎生致死性を回避する作業を進めており、現段階でN2世代まで継代し順調に増産している。以上の状況から、研究実施計画に照らし合わせ、やや遅れていると考えられる。

Strategy for Future Research Activity

FVB系統への戻し交配を繰り返し、世代毎に分子Xヘテロノックアウトマウス同士を交配させることで、各世代の致死性の回避率を割り出す。致死性の回避が充分認められた世代を元に、次の世代での実験に用いる匹数を確保する。p53が発がん過程で重要な役割を担っていることから、p53欠損マウスも並行してFVB系統への戻し交配を行っており、個体レベルでの分子Xとp53との発がんにおける関係性にも焦点を当てる予定である。細胞レベルでの解析においても、ダブルノックアウト等を作成し、分子Xとp53、相互作用群との関係性に関する機能解析を進める。

Causes of Carryover

FVB系統マウスへの戻し交配を主に行っていたので、マウスを用いた実験が進まなかった。そのため、マウスの購入費、維持費が予想よりも下回った。

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度に、戻し交配により得られたFVB系統ノックアウトマウスを実験に必要な数まで増産し、研究計画通りの実験を行うための費用に充てる予定である。また、細胞レベルの解析での、p53、相互作用因子との関係を解析するために研究費を使用する。