2018 Fiscal Year Annual Research Report
Roles of an atypical Wnt receptor, Ryk, for bone remodeling(Fostering Joint International Research)
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15KK0356
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| Research Institution | Matsumoto Dental University |
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Principal Investigator |
中道 裕子 松本歯科大学, 総合歯科医学研究所, 講師 (20350829)
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| Project Period (FY) |
2016 – 2018
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| Keywords | プロテオーム / ゲノム / シグナル伝達 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
（１）Rykシグナルのプロテオーム解析
前年度において、Rykのリガンドの一つであるWnt3aに対する応答について、C3H10T1/2, ST2, C2C12細胞を用いて骨芽細胞の分化指標であるアルカリフォスファターゼ(ALP)活性の比較により解析した。Wnt3aは、ST2細胞とC3H10T1/2細胞においてALP活性を用量依存的に上昇させた。一方、Wnt3aは、C2C12細胞においてWntシグナルレポーター遺伝子の活性は上昇させたもののALP活性は上昇させなかった。今年度においてプロテオーム解析は一番応答性の高かったST2細胞を用いて行った。リン酸化ペプチド質量分析は２回行った。５つのバイオロジカルレプリケートにおいて2種類のペプチドのリン酸化が再現性良くWnt3a処理によって亢進した。今後、活性化したリン酸化酵素を捕獲する方法である multiplexed kinase inhibitor beads を利用した質量分析も行い、リン酸化酵素およびその基質の同定を行う予定である。
（２）ゲノムワイドのRykシグナル下流遺伝子機能解析を行った。遺伝子機能解析のため、遺伝子機能獲得アプローチであるCRISPR-Aスクリーニングの系の立ち上げをした。Crispr-AコンポーネントとWnt活性レポーター共安定発現ST2モノクローナル細胞を取得した。今後ガイドRNAライブラリーの導入を行い、スクリーニングを実施する予定である。
（３）共同研究先で、Wnt3aに反応して、ネガティブフィードバック機構としてリン酸化酵素AAK1が、Wnt受容体をクラスリン依存性エンドサイトーシスを介して分解を促進することを見出した。この機構がWnt3a依存性骨芽細胞分化に関与しているか調べるため、AAK1阻害剤を骨芽細胞分化系に加えた。しかし、AAK1阻害剤はWnt3a依存性の骨芽細胞分化を促進しなかった。
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[Int'l Joint Research] ノースカロライナ大学チャペルヒル校(米国)2017
Year and Date
2017-09-05 – 2018-03-31
Country Name
U.S.A.
Counterpart Institution
ノースカロライナ大学チャペルヒル校
Co-investigator Overseas
Michael Ben Major
Department
Lineberger Cancer Center
Job Title
Associate Professor
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[Journal Article] WNT Activates the AAK1 Kinase to Promote Clathrin-Mediated Endocytosis of LRP6 and Establish a Negative Feedback Loop2019
Author(s)
Agajanian MJ, Walker MP, Axtman AD, Ruela-de-Sousa RR, Serafin DS, Rabinowitz AD, Graham DM, Ryan MB, Tamir T, Nakamichi Y, Gammons MV, Bennett JM, Counago RM, Drewry DH, Elkins JM, Gileadi C, Gileadi O, Godoi PH, Kapadia N, Muller S, Santiago AS, Sorrell FJ, Wells CI, Fedorov O, Willson TM, Zuercher WJ, Major MB
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Journal Title
Cell Reports
Volume: 26
Pages: 79～93.e8
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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