プロテインチップを用いたテーラーメード膵癌術後補助化学療法実用化の研究

2005 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16591296
• Research Institution: Chiba University
• Principal Investigator: 安蒜 聡 千葉大学, 医学部附属病院, 助手 (30251200)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 宮崎 勝 千葉大学, 大学院・医学研究院, 教授 (70166156) ; 吉留 博之 千葉大学, 大学院・医学研究院, 講師 (10312935) ; 大塚 将之 千葉大学, 医学部附属病院, 助手 (90334185) ; 伊藤 博 千葉大学, 大学院・医学研究院, 助教授 (00232463) ; 野村 文夫 千葉大学, 大学院・医学研究院, 教授 (80164739)
• Keywords: 膵癌 / Gemcitabine / プロテインチップ / テーラーメード

Research Abstract

・プロテインチップを用いた抗Annexin II抗体の血中スクリーニング
臨床検査部に設置され、既に使用しているProtein Chip System(CIPHAGEN)を用いた。同システムは表面増強レーザー脱離イオン化(SELDI)と飛行型質量分析計(TOF MS)とを組み合わせた方法である。本システムはプロテインチップ、質量分析計およびデータ解析コンピューターからなる。プロテインチップはアルミ板の表面にさまざまな化学的、生物学的装飾を施したものである。プロテインチップのうち、抗体結合チップに抗Annexin IIを結合させた。Annexin IIが強発現した膵癌組織ホモジネートをpositive controlとし、患者抹消血液中のAnnexin IIをスクリーニングする。患者血清は膵癌患者全員の術前、術後、化学療法前、化学療法後を採取し既に-20度に保管してある。またnegative controlは非癌患者である慢性膵炎や良性膵嚢胞患者血清を用いる。Sample bufferは50mM sodium acetate(pH4.5)および50mM Tris-HCl(pH8.5)の二種類にて行う。血清は7M Urea/2 Mthiourea/4% CHAPS/1% DTT/2% ampholitesをsample溶解液とし、PBSにて10倍希釈したものをさらに上記samole bufferで10倍希釈し最終100倍希釈にてチップと反応させた。この方法は、チップ表面にAnnexin IIと特異的に親和性のある抗体を結合させ、このAnnexin IIのみを分離・補足し、質量分析計で測定し分子量と発現量の情報を得るものである。同機はごく微量の蛋白でも検出可能である。また、同チップは同時に8検体測定が可能であり、同一チップ上に異なる条件下の試料を添加も可能である。既に分子量が判明し、かつ特異的抗体をチップに結合させ、血中Annexin IIを検出するため、実現可能である。
・プロテインチップを用いた抗Annexin II抗体の尿中スクリーニング
膵癌患者抹消血液中のAnnexin IIの検出が確認された後、患者尿中のスクリーニングを行う。既に血液と同様に患者40例の尿サンプルも採取し保管してある。上記、血清・尿検体は全て、おのおの10本ずつ分注され保管されている。方法は上記に記載したものとほぼ同様に行う。尿検体は血液に比べ、蛋白濃度が低いためcentricon 10にて濃縮を図った。
ヒト膵癌細胞株MIA-PaCa IIを用い、GEM耐性株樹立を試みた。GEM無添加培養液3週間培養後の細胞にて実験を行った。GEM濃度1ng/mlから10,000ng/mlまで細胞選択法にて行い、測定はMTT法にて行った。GEM濃度5ng/mlから1000ng/mlまで野生株に比し耐性株は有意に生存細胞数が多く、3ヶ月後にても耐性作用を維持し、耐性能を示したため報告した(Pancreas.2003;27:220-224)。さらに、その耐性株を用いて2次元電気泳動から分離精製した36kDa蛋白のアミノ酸N末端分析の結果、薬剤耐性因子(Annexin II)も同定した。