2016 Fiscal Year Annual Research Report
Molecular basis of cilia beating mode.
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16H02502
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
吉川 雅英 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 教授 (80272425)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 繊毛 / クライオ電子顕微鏡 / ゼブラフィッシュ / ダイニン / ゲノム編集 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
真核生物の運動性繊毛・鞭毛は、主に微小管と軸糸ダイニンで構成される細胞内小器官である。高等生物では、組織分化に伴い繊毛も多様化しており、左右軸を決定するノード繊毛の回転運動、精子鞭毛の正弦波様の運動など、様々な運動モードを呈する。それぞれの繊毛・鞭毛の運動モードは組織の働きと密接に関わっているため、異常によって繊毛病の原因となる。しかし、各組織での繊毛の運動モードを制御する仕組みは、明らかになっていない。本研究では、「組織間で異なる繊毛運動モードは、それを駆動する軸糸ダイニンの違いによる」という作業仮説を立て、これを検証することとした。モデル生物にはゼブラフィッシュを用いる。ゼブラフィッシュはCRISPR/Cas9によるゲノム編集技術が確立されているうえ、我々の研究室では、初めてゼブラフィッシュ精子のクライオ電子線トモグラフィー(Cryo-ET)による構造解析に成功している。したがって、以下の計画を遂行することで、脊椎動物の繊毛運動モードを制御する仕組みに迫る。
1. ゼブラフィッシュの軸糸ダイニン重鎖と関連遺伝子を、ゲノム編集技術を用いてノックアウト・不活性化し、繊毛運動モードを決定する軸糸ダイニンを特定する。
2. 繊毛運動モードを決定している軸糸ダイニンについて、Cryo-ETを用いて構造基盤を明らかにする。
軸糸ダイニン関連遺伝子としては、複数の軸糸ダイニンを欠損させる目的から、軸糸ダイニンの組み立てに関与する遺伝子に着目する。すでに４つの遺伝子について変異体を作製してあり、同様にCryo-ETを用いた構造解析を行う。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ゼブラフィッシュのゲノム中には13種類の軸糸ダイニン重鎖遺伝子が見つかっているが、ダイニン遺伝子が巨大であるため、6種類についてしか全長が明らかになっていない。残りの7種類について、遺伝子近傍のゲノムを他種（ヒト・マウス・メダカ・クラミドモナス）の軸糸ダイニン重鎖遺伝子と比較することで全長を明らかにした。これまでは変異体をCRISPR/Cas9によるランダムな変異によって作成していたが、CRISPR/Cas9と相同組み換え用のドナー配列をco-injectionして、任意にゲノムを編集できる系を新たに立ち上げた。現在、この系を用いてG0世代を飼育中である。
また、当研究室で確立したCryo-ETによるゼブラフィッシュ精子軸糸の三次元構造の手法についても改良を行い、より安定して明瞭な三次元構造が得られるようになっている。
ダイニン組み立て因子については、すでに作製済みの変異体4系統について解析を進めている。これらの変異体精子について、改良したCryo-ET法によってその軸糸構造を明らかにした。各変異体で特異的な軸糸ダイニンの欠損が観察され、それぞれの組み立て因子が制御する軸糸ダイニンのタイプを同定することができた。また、高速度カメラを用いた精子運動性の解析から、変異体での運動性の異常を明らかにした。異常の程度は各変異体で異なっており、欠損する軸糸ダイニンのタイプと、精子運動性を対応づけられる可能性が示唆された。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は引き続きCRISPR/Cas9を用いた変異体作製を行い、各軸糸ダイニン重鎖遺伝子を欠損したホモ系統を確立する予定である。そして、それぞれの変異体の繊毛運動性を解析することで、繊毛運動モードを決定する軸糸ダイニンを明らかにする。また、Cryo-ETを用いた軸糸構造解析から、その構造的な基盤を解明していく。
一方で、繊毛は非常に複雑な構築過程を取っているため、軸糸ダイニンの欠損がその周辺の構造を変化させてしまう可能性がある。この場合、現れる表現型は純粋に欠損したダイニンに因るものではない。また、欠損遺伝子がゼブラフィッシュの発生過程で非常に重要な役割を果たしており、変異体が精子形成以前に致死となってしまう可能性も考えられる。そのような場合には、特定のドメインのみを欠損する系統や、点変異によって軸糸ダイニンを不活性化した系統など、よりマイルドな変異を導入することで対応する。
最終的には、繊毛運動モードを決定する軸糸ダイニンが生理的な条件でどのように働いているかを解析する。そのためには、軸糸ダイニンの特定の部位に標識を導入し、その構造と動きを観察する必要がある。我々はクラミドモナスにおいて、ビオチン化される標識を用いて分子の局在を解析する手法を確立しており、これをゼブラフィッシュに応用する予定である。標識された軸糸ダイニンの軸糸中での振る舞いを、蛍光顕微鏡や、Cryo-ETで観察することで、その運動制御のメカニズムを明らかにする。
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[Presentation] 繊毛・鞭毛の「構造遺伝学」2017
Author(s)
吉川雅英
Organizer
第122回日本解剖学会総会・全国学術集会
Place of Presentation
長崎大学坂本キャンパス(長崎県長崎市)
Year and Date
2017-03-28 – 2017-03-30
Invited
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