2016 Fiscal Year Annual Research Report
Discovery of drug resistant mechnism by kinome analysis using patient derived cultured cells
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16H04707
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| Research Institution | National Institutes of Biomedical Innovation, Health and Nutrition |
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Principal Investigator |
朝長 毅 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所, 医薬基盤研究所 プロテオームリサーチプロジェクト, プロジェクトリーダー (80227644)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
西尾 誠人 公益財団法人がん研究会, 有明病院 呼吸器内科, 部長 (00281593)
藤田 直也 公益財団法人がん研究会, がん化学療法センター, 所長 (20280951)
片山 量平 公益財団法人がん研究会, がん化学療法センター 基礎研究部, 主任研究員 (60435542)
長山 聡 公益財団法人がん研究会, 有明病院 消化器外科, 医長 (70362499)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | リン酸化プロテオーム解析 / 薬剤耐性機序 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、分子標的薬の登場によりがん治療は画期的に進歩した。その反面、薬剤に対する抵抗性が問題となっている。本研究では、１．大規模リン酸化プロテオミクスとインフォマティクスを用いた網羅的キナーゼ活性解析により、薬剤抵抗性の機序の解明を行い、２．その方法を肺がん、大腸がん患者由来の培養細胞株やマウスXenograftモデルに応用し、薬剤抵抗性克服及び患者ごとに最適な治療法の提案を行う。網羅的キナーゼ活性解析による薬効予測や耐性機序の解明及び患者由来細胞を用いた解析は世界初の試みであり、これが臨床応用されれば、副作用の少ない最適な個別化医療の遂行が可能となり、がん治療の質の向上のみならず医療費の削減に貢献できる。
平成28年度は、既存の培養細胞株を用いた網羅的キナーゼ活性解析法の構築及び肺がん、大腸がんの薬剤感受性株と抵抗性株を用いた薬剤抵抗性の機序の解明を行う。具体的には、１．培養細胞株を用いた網羅的キナーゼ活性解析法の構築、２．既存の肺がん、大腸がんの薬剤感受性株と抵抗性株を用いた薬剤抵抗性の機序の解明である。
まず、独自の前処理法と高感度質量分析計を用いて同定された3万種類以上のリン酸化サイトについて、独自のバイオインフォマティクスを用いて、網羅的にキナーゼ活性を推定する手法を構築する。次に、構築した網羅的キナーゼ活性推定法を用いて、臨床で用いられている薬剤（エルロチニブ、セツキシマブ）に対して耐性を示す既存の肺がんと大腸がんの細胞株についてリン酸化プロテオーム解析を行い、網羅的キナーゼ活性を推定する。薬剤耐性群で共通して高値を示すリン酸化基質およびその責任キナーゼが薬剤耐性関連因子である。
それと平行して、分子標的薬療法対象肺がん、大腸がん患者由来の培養細胞株とXenograftモデルの作製を行う。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
薬剤の直接のターゲットであるキナーゼの活性化状態を指標とした薬剤感受性予測法（コンパニオン診断薬）の技術開発を行った。キナーゼの中で最も多くの阻害剤の標的となっている受容体型チロシンキナーゼ(RTK)の活性を予測するために、チロシンリン酸化プロテオーム解析法の高感度化を行った。最終的に定常状態の培養細胞株から1000個～1600個のチロシンリン酸化を定量することが可能になった (先行研究の3倍の同定数、Abe et al., J Proteome Res in press)。
次に臨床サンプルを解析する前段階として、大腸がんと肺がん培養細胞株を用いた解析を行った。それぞれの薬剤感受性細胞株と耐性細胞株の解析から、薬剤感受性予測に有用なキナーゼを複数特定し、そのキナーゼ阻害剤によって、耐性細胞株の細胞増殖を抑制できることを確認した。特に、大腸がんのセツキシマブ耐性培養細胞株を用いた実験から、EGFR-SRC-PRKCDカスケードのシグナルが活性化していることを同定し、そのカスケード上にあるキナーゼ阻害剤がセツキシマブ耐性大腸がん培養細胞の増殖を抑制することを見出した（Sci Rep under review）。
がん研究会有明病院でEGFR-TKI治療を受けたEGFR変異陽性非小細胞肺がん患者235例のうち，EGFR-TKIが無効となった127例で肺がん細胞株樹立のために再生検を行い、組織検体の収集を行うとともに臨床情報の集積を行った。また、大腸がん細胞株樹立のために、156例の大腸がん組織検体を採取し、これらの症例の臨床情報の収集は完了した。
上記の進行肺がん患者ならびに進行大腸がん患者の体腔液検体、生検検体、または手術検体を用いて、これまでに培養細胞株：肺がん細胞株（6株）・大腸がん細胞株（10株）を樹立した。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成29年度以降は、前年度作製した患者由来細胞株及びXenograftモデルを用いて、網羅的キナーゼ活性解析法を用いた薬剤耐性に関わる因子の同定を行う。患者由来薬剤耐性細胞株およびその細胞株を移植したXenograftモデルに対して、同定された薬剤耐性にかかわるキナーゼの阻害剤で処理し、細胞増殖抑制効果がみられるか検討する。また、キナーゼ阻害剤で増殖に影響がみられた場合でも、その効果がキナーゼ阻害剤のオフターゲット効果による可能性があるので、その因子についてRNAiによるノックダウンまたはCRISPR-CAS9を用いたノックアウトにより確認する。以上の解析から、薬剤抵抗性獲得機序の解明を行う
さらに、現在分子標的薬の対象とならない症例に対して、遺伝子変異によらない薬効予測法の開発を行い、各症例に最適な治療法を提案する。具体的には、分子標的薬療法の対象から外れた症例および分子標的薬に耐性になった患者から培養細胞株を作製し、網羅的キナーゼ活性推定法を用いて、患者をいくつかのサブタイプに分類し、それぞれに適したキナーゼ阻害剤療法を提案する。それにより、化学療法と比べてより副作用の少ない治療を受けることが可能になると思われる。
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