2016 Fiscal Year Annual Research Report
虚血性心疾患感受性分子群をターゲットとした創薬とその機能解析
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16H04726
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| Research Institution | National Center for Geriatrics and Gerontology |
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Principal Investigator |
尾崎 浩一 国立研究開発法人国立長寿医療研究センター, メディカルゲノムセンター 臨床ゲノム解析推進部, 部長 (50373288)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
伊藤 薫 国立研究開発法人理化学研究所, 統合生命医科学研究センター, チームリーダー (50375664)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | BRAP / NFKBIB / 結合抑制低分子 / FURIN / LDLR / ELISA系 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は主に虚血性心疾患感受性分子BRAPとその調節分子であるNFKBIB (IkB-beta)の結合を阻害できる低分子化合物の探索に注力した。まず、低分子化合物を探索するためのスクリーニング系の構築を進め、当初、BRAPおよびNFKBIBの大量精製を大腸菌やカイコの系で行うことを試みたが、いずれも大量精製には向かないことが判明したため、プロメガのnano-lucの系も同時に試みたがうまくワークしなかった。結果的にサル腎臓細胞株であるCOS7細胞を用いた動物細胞の系で、これらの精製を試みたところ、Sタグを付加したBRAPとFLAGタグによるNFKBIBの大量精製に成功した。これらのタンパクを用いてEnzyme linked immuno solvent assay (ELISA)系の開発を進め、アッセイ系の評価を行ったところ、非常に良好なアッセイ系を確立することができた（CV < 3、シグナルバックグランド比 = ～50、Z' factor = 0.97)。このELISA系と東大創薬機構から提供を受けた10,000コアライブラリを使用して、BRAP-NFKBIBの阻害分子を探索したところ、その結合を40-50%抑制できる3個の創薬候補化合物を同定した。また、もう一つの創薬ターゲットであるFURIN-LDLRについても現在までにBRAP-NFKBIBと同様のELISA系を確立することに成功している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
BRAP-NKBIBの結合を阻害する低分子化合物の同定では、精度の良いスクリーニング系を確立し、実際に10,000コア低分子ライブラリーをシステマテックにスクリーニングして、終濃度2uMでこれらの結合を40～50%阻害する3個の創薬候補低分子化合物を探索することができた。また、FURIN-LDLRについても同様の系を確立し10,000低分子化合物のスクリーニングを行える準備が整った。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度の計画としては、これら3個の創薬候補低分子化合物について、①培養細胞系での結合阻害を確認する②培養細胞におけるNuclear Factor kappa N (NFkB)の活性化阻害作用の確認③培養血管平滑筋細胞の増殖阻害効果、血管内皮細胞との3次元（ボイデンチャンバー）培養ヒト血管平滑筋細胞の遊走能阻害効果を進める。FURIN-LDLRについてはBRAPの昨年度同様に10,000コア低分子化合物について東大創薬機構から提供を受け、そのスクリーニングによる、FURIN-LDLR結合阻害候補分子化合物の同定、バリデーションを中心に進める。また、FURIN分子がLDLR分子の安定性に寄与していることは推察がつくが、その詳細な機能については未だ不明な点が多い。したがって、FURINについてはさらにLDLRとの結合やその機能について詳細に解析し、新たな生体内機能概念についての構築を可能な限り進める。
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[Journal Article] Identification of six novel genetic loci associated with atrial fibrillation in Japanese population.2017
Author(s)
Low SK, Takahashi A, Ebana Y, Ozaki K, Christophersen IE, Ellinor PT, AFGen Consortium, Ogishima S, Yamamoto M, Satoh M, Sasaki M, Yamaji T, Iwasaki M, Tsugane S, Tanaka K, Naito M, Wakai K, Tanaka H, Furukawa T, Kubo M, Ito K, Kamatani Y, Tanaka T.
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Journal Title
Nature Genetics
Volume: -
Pages: -
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Journal Article] A functional SNP in FLT1 increases risk of coronary artery disease in a Japanese population.2016
Author(s)
Konta A, Ozaki K, Sakata Y, Takahashi A, Morizono T, Suna S, Onouchi Y, Tsunoda T, Kubo M, Komuro I, Eishi Y, Tanaka T.
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Journal Title
Journal of Human Genetics
Volume: 61
Pages: 435, 441
DOI
Peer Reviewed
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