コムギ無細胞系とNGS技術を融合したドチザメナノボディ選抜・構築技術の開発

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16H04729
• Research Institution: Ehime University
• Principal Investigator: 澤崎 達也 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 教授 (50314969)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: タンパク質 / ナノボディ / 無細胞 / 抗体 / サメ / ドチザメ / トランスクリプトーム

Outline of Annual Research Achievements

本年度は、ドチザメナノボディ開発の基盤データと なる、世界初のドチザメ血球細胞由来RNAを用いた次世代シークエンサーによる、ドチザメ科4種の免疫系のwhol e transcriptome解析を行った。ドチザメの飼育および採血は、愛媛県栽培資源研究所と共同で行った。
I.ドチザメ科サメ4種の免疫系遺伝子発現解析
1) 免疫系遺伝子群の評価：ドチザメ科4種類(ドチザメ、シロザメ、ホシザメ、エイラクブカ)からそれぞれ採血し、挑戦的萌芽予算で確 立したドヂザメ血液からのRNA単離法を用いて、DNAのコンタミを極力無くした単離RNAを材料に、Illumina社HiS eq1500によるRNA-seq解析を行い、これまでにサメでは報告のなかった、Toll様受容体などを新たに見出すことに成功した。
2) 完全長ドヂザメナノボディ遺伝子のクローン化：ドチザメ以外のシロザメ、ホシザメ、エイラクブカのナノボディ遺伝子(完全長の場合IgNAR遺伝子と)の配列 は未知であった。I-1)で得られた配列データからプライマーをデザインし、最終的RT-PCRにより完全長ナノボディ 遺伝子を単離するができた。
3)免疫抗原応答性ドチザメナノボディ遺伝子発現解析：本年度は、モデルとしてGFP抗原を用いて実験を行った。 複数匹のドチザメ科4種の抗原GFP免疫の前後の血液を採血し、新たにドチザメナノボディ認識抗体を用いて、抗原により誘導されたナノボディを検出することができた。その結果、１種類のドチザメ種において、抗原依存的なナノボディの産生が確認できた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の予定通り、研究は進んでいる。ドチザメナノボディおよびigWを認識する抗体産生に成功し、サメの種類によっては、ナノボディよりもIgWの誘導が多い種がいることには驚きであった。

Strategy for Future Research Activity

平成29年度は、ドチザメナノボディの単離および評価系構築を行う。これにより、4種のドチザメナノボディの抗体価などの評価ができると同時に、組換え単一ナノボディの選抜が可能となるため、我々が既に保持している抗体との比較から、サメを免疫生物種とすることによる、抗原性の広がり、抗体価、安定性など、ドヂザメナノボディの利点と欠点を評価できるものと思われる。

Research Products

• [Journal Article] Interaction between RNF8 and DYRK2 is required for the recruitment of DNA repair molecules to DNA double-strand breaks. (2017)
  • Author(s): Yamamoto T, Taira Nihira N, Yogosawa S, Aoki K, Takeda H, Sawasaki T, Yoshida K.
  • Journal Title: FEBS Letters Volume: 591 Pages: 842-853
  • DOI: 10.1002/1873-3468.12596.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] HTLV-1 Tax Induces Formation of the Active Macromolecular IKK Complex by Generating Lys63- and Met1-Linked Hybrid Polyubiquitin Chains. (2017)
  • Author(s): Shibata Y, Tokunaga F, Goto E, Komatsu G, Gohda J, Saeki Y, Tanaka K, Takahashi H, Sawasaki T, Inoue S, Oshiumi H, Seya T, Nakano H, Tanaka Y, Iwai K, Inoue JI.
  • Journal Title: PLOS Pathogens Volume: 13 Pages: e1006162
  • DOI: 10.1371/journal.ppat.1006162
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] OsMYC2, an essential factor for JA-inductive sakuranetin production in rice, interacts with MYC2-like proteins that enhance its transactivation ability. (2017)
  • Author(s): Ogawa S, Miyamoto K, Nemoto K, Sawasaki T, Yamane H, Nojiri H, Okada K.
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 7 Pages: 40175
  • DOI: 10.1038/srep40175.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Plant Aurora kinases interact with and phosphorylate transcription factors. (2016)
  • Author(s): Takagi M, Sakamoto T, Suzuki R, Nemoto K, Obayashi T, Hirakawa T, Matsunaga TM, Kurihara D, Nariai Y, Urano T, Sawasaki T, Matsunaga S.
  • Journal Title: Journal of Plant Research Volume: 129 Pages: 1165-1178.
  • DOI: 10.1007/s10265-016-0860-x
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Bach2-Batf interactions control Th2-type immune response by regulating the IL-4 amplification loop. (2016)
  • Author(s): Kuwahara M, Ise W, Ochi M, Suzuki J, Kometani K, Maruyama S, Izumoto M, Matsumoto A, Takemori N, Takemori A, Shinoda K, Nakayama T, Ohara O, Yasukawa M, Sawasaki T, Kurosaki T, Yamashita M.
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 7 Pages: 12596
  • DOI: 10.1038/ncomms12596.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Linear ubiquitination is involved in the pathogenesis of optineurin-associated amyotrophic lateral sclerosis. (2016)
  • Author(s): Nakazawa S, Oikawa D, Ishii R, Ayaki T, Takahashi H, Takeda H, Ishitani R, Kamei K, Takeyoshi I, Kawakami H, Iwai K, Hatada I, Sawasaki T, Ito H, Nureki O, Tokunaga F.
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 7 Pages: 12547
  • DOI: 10.1038/ncomms12547.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Dysregulation of a potassium channel, THIK-1, targeted by caspase-8 accelerates cell shrinkage. (2016)
  • Author(s): Sakamaki K, Ishii TM, Sakata T, Takemoto K, Takagi C, Takeuchi A, Morishita R, Takahashi H, Nozawa A, Shinoda H, Chiba K, Sugimoto H, Saito A, Tamate S, Satou Y, Jung SK, Matsuoka S, Koyamada K, Sawasaki T, Nagai T, Ueno N.
  • Journal Title: Biochimica et Biophysica Acta Volume: 1863 Pages: 2766-2783
  • DOI: 10.1016/j.bbamcr.2016.08.010.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] MyoD reprogramming requires Six1 and Six4 homeoproteins: genome-wide cis-regulatory module analysis. (2016)
  • Author(s): Santolini M, Sakakibara I, Gauthier M, Ribas-Aulinas F, Takahashi H, Sawasaki T, Mouly V, Concordet JP, Defossez PA, Hakim V, Maire P.
  • Journal Title: Nucleic Acids Research Volume: 44 Pages: 8621-8640
  • DOI: 10.1093/nar/gkw512
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Nod2-Nodosome in a Cell-Free System: Implications in Pathogenesis and Drug Discovery for Blau Syndrome and Early-Onset Sarcoidosis. (2016)
  • Author(s): Iwasaki T, Kaneko N, Ito Y, Takeda H, Sawasaki T, Heike T, Migita K, Agematsu K, Kawakami A, Morikawa S, Mokuda S, Kurata M, Masumoto J.
  • Journal Title: The Scientific World Journal Volume: － Pages: 2597376
  • DOI: 10.1155/2016/2597376
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] H11/HSPB8 Restricts HIV-2 Vpx to Restore the Anti-Viral Activity of SAMHD1. (2016)
  • Author(s): Kudoh A, Miyakawa K, Matsunaga S, Matsushima Y, Kosugi I, Kimura H, Hayakawa S, Sawasaki T, Ryo A.
  • Journal Title: Frontiers in Microbiology Volume: 7 Pages: 883
  • DOI: 10.3389/fmicb.2016.00883.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] AGIA Tag System Based on a High Affinity Rabbit Monoclonal Antibody against Human Dopamine Receptor D1 for Protein Analysis. (2016)
  • Author(s): Yano T, Takeda H, Uematsu A, Yamanaka S, Nomura S, Nemoto K, Iwasaki T, Takahashi H, Sawasaki T.
  • Journal Title: PLoS One Volume: 11 Pages: e0156716
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0156716.
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Establishment of a Wheat Cell-Free Synthesized Protein Array Containing 250 Human and Mouse E3 Ubiquitin Ligases to Identify Novel Interaction between E3 Ligases and Substrate Proteins. (2016)
  • Author(s): Takahashi H, Uematsu A, Yamanaka S, Imamura M, Nakajima T, Doi K, Yasuoka S, Takahashi C, Takeda H, Sawasaki T.
  • Journal Title: PLoS One Volume: 11 Pages: e0156718
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0156718.
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Gfi1, a transcriptional repressor, inhibits the induction of the T helper type 1 programme in activated CD4 T cells. (2016)
  • Author(s): Suzuki J, Maruyama S, Tamauchi H, Kuwahara M, Horiuchi M, Mizuki M, Ochi M, Sawasaki T, Zhu J, Yasukawa M, Yamashita M.
  • Journal Title: Immunology Volume: 147 Pages: 476-487
  • DOI: 10.1111/imm.12580.
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 大学・自治体協同による地方大学発バイオベンチャーの生き残り術 (2016)
  • Author(s): 澤崎達也
  • Organizer: 平成２８年度 地域コトづくりセンター報告会＆シンポジウム
  • Place of Presentation: 鹿児島大学（鹿児島県鹿児島市）
  • Year and Date: 2016-11-25
  • Invited
• [Presentation] プロテオーム大規模解析が切り開く新たな生化学研究：コムギ無細胞系を基盤とした２つの大規模生化学的解析法：ヒト２万種プロテインアレイによるインタラクトーム解析とケミカルバイオロジーに向けた薬剤開発 (2016)
  • Author(s): 澤崎達也, 高橋宏隆
  • Organizer: 第89回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 東北大学・仙台国際センター（宮城研仙台市）
  • Year and Date: 2016-09-25 – 2016-09-27
  • Invited
• [Presentation] コムギ無細胞系を基盤とした蛋白質の合成・機能解析技術 (2016)
  • Author(s): 澤崎達也
  • Organizer: 第40回蛋白質と酵素の構造と機能に関する九州シンポジウム
  • Place of Presentation: 指宿ベイテラス（鹿児島県指宿市）
  • Year and Date: 2016-08-26
  • Invited
• [Presentation] コムギ無細胞技術を基盤とした研究支援 (2016)
  • Author(s): 澤崎達也
  • Organizer: 神戸大学バイオシグナル総合研究センター設置記念シンポジウム
  • Place of Presentation: 神戸大学（兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2016-08-22
  • Invited
• [Presentation] 医学・農学ケミカルバイオロジーに向けたコムギ無細胞基盤薬剤開発 (2016)
  • Author(s): 澤崎達也
  • Organizer: アグリバイオ工学研究部門公開セミナー
  • Place of Presentation: 東京理科大学（東京都葛飾区）
  • Year and Date: 2016-06-20
  • Invited
• [Remarks] 澤崎研HP
  • URL: http://www.pros.ehime-u.ac.jp/cell-free/index.html