2017 Fiscal Year Annual Research Report
コムギ無細胞系とNGS技術を融合したドチザメナノボディ選抜・構築技術の開発
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16H04729
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
澤崎 達也 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 教授 (50314969)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | タンパク質 / ナノボディ / 無細胞 / 抗体 / サメ / Fukabody / ドチザメ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
前年に、ドチザメ科のエイラクブカ、シロザメ、ホシザメの３種のRNAを混合したサンプルを用いて、免疫関連遺伝子群およびドチザメ抗体（Fukabody）遺伝子のwhole transcriptome解析を行った。本年度は、Fukabodyの評価系の構築を目指し、ドチザメ科IgNAR遺伝子のクローニングを行った。さらにVenusタンパク質をモデルに、エイラクブカのFukabodyの単離、抗体価評価に成功した。得られた抗VenusFukabodyを用いてFukabodyの評価系の構築を行った。
II．Fukabodyの評価系の確立
1) Fukabody検出抗体の構築
前年度の配列情報を元にRT-PCRを行った結果、ホシザメ、エイラクブカのIgNAR遺伝子のクローニングに成功した。得られた遺伝子配列情報を元に、エイラクブカのIgNARのコンスタント領域のタンパク質を大腸菌で合成し、ウサギに免疫し、抗エイラクブカIgNAR認識2次抗体の作製を行い、その結果、３種のFukabody遺伝子の配列情報とホシザメ、エイラクブカのIgNAR遺伝子のクローニングに成功した。 次に、Venusタンパク質をそれら3種のサメに免疫した結果、エイラクブカの血液中に抗原依存的なIgNARの誘導が確認されたので、免疫したエイラクブカの脾臓を単離し、Fukabody遺伝子領域をPCRで増幅し、ファージライブラリーを作製し、Venusタンパク質に結合するFukabodyを３種類単離することに成功した。 得られたFukabodyを抗体評価を行ったところ、Fukabodyは80℃で１時間ボイルしても活性を保持しており、抗体価は平均で約１０E-08であることが分かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
当初の予定通り進み、抗原に特異的結合するFukabodyの単離に成功した。また、Fukabodyタンパク質の発現系の構築に成功し、mgオーダーでFukabodyが生産できる体制が確立できた。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成30年度は、抗原に結合したFukabodyの構造解析を行う。これにより、Fukabodyがどの様な構造を形成し、抗原を認識しているか理解できると期待される。
また、次世代シークエンスの解析を行い、抗原特異的なFukabodyの選抜過程を配列情報としてトレースしたい。
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