2017 Fiscal Year Annual Research Report
Structural and Functional analyses of iron-sulfur clusters biogenesis systems under the anaerobic conditions
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16H04754
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| Research Institution | University of Miyazaki |
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Principal Investigator |
和田 啓 宮崎大学, 医学部, 准教授 (80379304)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
高橋 康弘 埼玉大学, 理工学研究科, 教授 (10154874)
藤田 祐一 名古屋大学, 生命農学研究科, 教授 (80222264)
福山 恵一 大阪大学, 工学研究科, 招へい研究員 (80032283)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 鉄硫黄クラスター / 結晶構造 / 無酸素実験 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
鉄硫黄クラスター(Fe-S)は、酸素に脆弱なタンパク質コファクターである。Fe-S クラスターが生体内において、どこでどのように生合成されるのか、その分子機構解明は遅々として進んでいない。この原因は、Fe-S クラスターの酸素へ不安定性にあり、遺伝学的には生合成マシナリー群は同定されたものの、合成途上のクラスターを実験的に捉えた例は皆無である。
本課題では、細胞内をミミックした無酸素条件下での機能解析を遂行し、クラスター合成反応を試験管内でコントロールする新たな系(無細胞"ex situ"系)を確立することを目指している。さらに、ダイナミックな構造変化を伴う生合成コア複合体の動きを固定・制御することで、多段階に亘る合成途上の中間体クラスターをトラップし、それらの配位構造から生合成メカニズムを解き明かす。また、無細胞クラスター合成系を利用した新規センサーFe-S タンパク質 CnfR の構造機能解析も展開する。これらの目的を達成するために、本年度は以下の項目を実施した。
・H28年度に作製した変異コア複合体の発現・精製を進め、機能残基はβ－ヘリックスコアドメインN末端側の機能領域に位置しており、Fe-Sクラスターの新規形成部位と予想されるSufBとSufDの会合面までは 25A以上離れていることを明らかにした。さらに、SufBのβ－ヘリックスコアドメインの内部に硫黄原子を運搬するトンネルを見出した。
・前年度に作製したCnfRの発現系を用いて、今年度は無酸素条件下での精製を進めた。その結果、C末端に精製Tagを付加したCnfRを用いて、Fe-Sクラスターが結合した状態での大量精製に成功した。このFe-Sクラスター結合型CnfRの結晶化スクリーニングを進めた。さらに、ゲルシフトアッセイによりCnfRが結合するDNA断片の検討を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
平成２９年度の計画書では、[1]コア複合体の精製、[2]Fe-Sクラスター結合型CnfR の精製・結晶化スクリーニングを掲げていた。前年度の実験計画の遅れを取り戻し、さらに申請段階での平成２９年度の実施項目は実施済みである。さらに、次年度に計画していたCnfRのゲルシフトアッセイも進めることができており、当初の計画以上に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成２９年度の計画書では、[1]コア複合体の精製、[2]Fe-Sクラスター結合型CnfR の精製・結晶化スクリーニングを掲げていた。前年度の実験計画の遅れを取り戻し、さらに申請段階での平成２９年度の実施項目を順調に進めることが出来ている。既に平成３０年度の実施計画は前倒しで進ませているが、実験項目は計画書通りに進める予定である。
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