キュウリモザイクウイルスサテライトRNAによるタバコ黄化誘導機構の全容解明

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16H04880
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 増田 税 北海道大学, 農学研究院, 教授 (60281854)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: サテライトRNA / サイレンシング / キュウリモザイクウイルス / 黄化

Outline of Annual Research Achievements

キュウリモザイクウイルス（CMV）のサテライトRNA（satRNA）はCMVに寄生して増殖する300～400塩基の短いnon-coding RNAである。satRNAは大抵の場合、CMVの病徴を軽減するが、我々が研究材料としたY-satRNA（Y-sat）はCMVに感染したタバコを鮮黄色に変化させる。Y-satの存在のみで、なぜ劇的な病徴の変化が生じるのか長年の謎であった。我々は数年前に、この黄化病徴の誘導の原因として、クロロフィルの合成酵素遺伝子（ChlI）が宿主のRNAサイレンシング（RS）によって分解されるためであることを明らかにしている。今年度は、RS経路の重要な因子の中から２本鎖RNA分解酵素であるDCL2とDCL4がY-satの黄化病徴誘導にどのように関わるのか解析するため、DCL2/DCL4のノックダウンタバコを作出した。Real-time RT-PCRによってそれらの発現が低下していることを確認した後、DCL2/4によって生成される21-ntと22-ntのsiRNAを解析した。siRNAをノーザンブロットで解析した結果、これらの蓄積が著しく減少しており、それとは対照的に24-ntのsiRNAが相補するように増加していた。この形質転換植物にY-satを接種したところ、予想に反してタバコが黄化したことから、ChlIに対するRSは24-nt siRNAによるものと考えられ、これまでArabidopsisの研究からわかっていた知見とは異なる新現象であることが判明した。もし、タバコで24-nt siRNAが21-ntや22-nt siRNAを相補するようにヒエラルキーができているのであれば、エピジェネティクス制御は、植物によってRS因子の役割が異なっていることを示唆するものである。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

今年度得られた成果は、Y-satRNAによるタバコの黄化が、２本鎖RNA切断酵素であるDCL2とDCL4によって生成する21-nt 及び22-nt siRNAのみならず、DCL3によって生成する24-nt siRNAによっても、DCL2/4のノックダウン化で誘導されるという新知見である。これは当初の予想になかったことであるが、先行しているArabidopsisによる定説とは矛盾するものであり、植物によってRSの制御のしかたが異なっていることを示すおもしろい現象であると考えている。なお、DCL2とDCL4を認識する抗体を作成することにチャレンジしたが、in vitroで合成したタンパク質には反応するものの、植物から抽出したタンパク質では、明瞭なバンドが得られなかった。おそらく発現量が微量であり、ウエスタンによって検出することは難しいのかもしれない。

Strategy for Future Research Activity

次年度は、この新発見を踏まえて、DCL2/4のノックダウン下で生成する24-nt siRNAについてさらに解析する。Arabidopsisでは24-nt siRNAがｍRNAを切断することができないことが定説になっているため、DCL2/4ノックダウンタバコで、ChlI mRNAが実際切断されるのか興味深い点であり、5’ RACE法によってこれを検証する。また、RS経路に重要なsecondary siRNA増幅システムの担い手であるRDR6をCMV H1ベクターによって発現抑制し、黄化への影響を観察する。H1ベクターは転写後サイレンシング（PTGS）を効率よく誘導できない性質があり、このベクターに組み込んだRDR6の配列をアンチセンスRNAとしてRDR6の発現をターゲットすることができる。

Research Products

• [Journal Article] Interaction between Cucumber mosaic virus 2b protein and plant catalase induces a specific necrosis in association with proteasome activity (2017)
  • Author(s): Murota, K., Shimura, H., Takeshita, M. and Masuta, C.
  • Journal Title: Plant Cell Report Volume: 36 Pages: 37-47
  • DOI: 10.1007/s00299-016-2055-2
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Ascorbic acid accumulates as a defense response to Turnip mosaic virus in resistant Brassica rapa cultivars. (2016)
  • Author(s): ujiwara, A., Togawa, S., Hikawa, T., Matsuura, H., Masuta, C. and Inukai, T.
  • Journal Title: Journal of Experimental Botany Volume: 67 Pages: 4391-4402
  • DOI: 10.1093/jxb/erw223
• [Journal Article] Aquaporin-mediated long-distance polyphosphate translocation directed towards the host in arbuscular mycorrhizal symbiosis: application of virus-induced gene silencing. (2016)
  • Author(s): Kikuchi, Y., Hijikata, N., Ohtomo, R., Handa, Y., Kawaguchi, M., Saito, K., Masuta, C., Ezawa, T.
  • Journal Title: New Phytologist Volume: 211 Pages: 1202-1208
  • DOI: 10.1111/nph.14016
• [Journal Article] Chemical Promotion of Endogenous Amount of ABA in Arabidopsis thaliana by a Natural Product, Theobroxide. (2016)
  • Author(s): Yamashita, Y., Ota, M., Inoue, Y., Hasebe, Y., Okamoto, M., Inukai, T., Masuta, C., Sakihama, Y., Hasidoko, Y., Kojima, M., Sakakibara, H., Inage, Y., Takahashi, K., Yoshihara, T., and Matsuura H.
  • Journal Title: Plant Cell and Physiology Volume: 57 Pages: 986-999
  • DOI: 10.1093/pcp/pcw037
• [Presentation] Rhizophagus clarus-ウイルス間相互作用に駆動される酸性土壌適応：大陸間隔離株の共通ウイルスは酸性土壌において正の選択圧を受ける (2016)
  • Author(s): 鈴木芽以、中西夏輝、丸山隼人、俵谷圭太郎、増田税、江沢辰広
  • Organizer: 菌根研究会2016年大会
  • Place of Presentation: 千葉大学西千葉キャンパス（千葉県千葉市）
  • Year and Date: 2016-12-10
• [Presentation] キュウリモザイクウイルス2bタンパク質によるゲノムワイドなメチル化に関するin silico解析 (2016)
  • Author(s): 白川千里、外川靖子、犬飼剛、増田税
  • Organizer: 日本植物病理学会北海道部会
  • Place of Presentation: かでる2・7（北海道札幌市）
  • Year and Date: 2016-10-19 – 2016-10-20
• [Presentation] 茎頂培養によりウイルスフリー化した八紘ニンニクの収量・品質の変化 (2016)
  • Author(s): 両國香、志村華子、増田税
  • Organizer: 日本植物病理学会北海道部会
  • Place of Presentation: かでる2・7（北海道札幌市）
  • Year and Date: 2016-10-19 – 2016-10-20
• [Presentation] Cucumber mosaic virus感染後のトウガラシにおけるアスコルビン酸代謝関連遺伝子群のエピジェネティクス発現制御 (2016)
  • Author(s): 妙中駿之、古谷未咲、松村健、増田税
  • Organizer: 日本植物病理学会北海道部会
  • Place of Presentation: かでる2・7（北海道札幌市
  • Year and Date: 2016-10-19 – 2016-10-20
• [Presentation] ウイルス外被タンパク質遺伝子を欠失させたCMVベクターを用いたアグロインフェクション法 (2016)
  • Author(s): 福澤徳穂、佐藤敦子、増田税、松村健
  • Organizer: 日本植物細胞分子生物学会
  • Place of Presentation: 信州大学繊維学部（長野県上田市）
  • Year and Date: 2016-09-01 – 2016-09-03
• [Presentation] Cucumber mosaic virus 2b protein alters the plant epigenomes (2016)
  • Author(s): Yasuko TOGAWA, Raku SAITO, Senri SHIRAKAWA, Chikara MASUTA
  • Organizer: The Plant Biotech 2016
  • Place of Presentation: Queen's University in Kingston, ON, Canada
  • Year and Date: 2016-06-19 – 2016-06-21