2016 Fiscal Year Annual Research Report
簡便かつ鋭敏な細胞性免疫機能測定による水産用ワクチン有効性評価法の開発
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16H04984
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
中西 照幸 日本大学, 生物資源科学部, 教授 (00322496)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
間野 伸宏 日本大学, 生物資源科学部, 准教授 (10339286)
杣本 智軌 九州大学, 農学研究院, 准教授 (40403993)
荒木 亨介 鹿児島大学, 農水産獣医学域水産学系, 准教授 (30409073)
高野 倫一 国立研究開発法人水産研究・教育機構, 増養殖研究所, 研究員 (40533998)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 細胞傷害活性 / グランザイム / 鰭膜内接種 / 好中球 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1. 細胞傷害性誘導酵素グランザイムAの精製と特性解明：魚類においては、グランザイムの特性や機能は全く不明である。そこで本研究では、アロ抗原に対する細胞傷害活性に関与するグランザイム様酵素をギンブナ白血球より精製し、タンパク質レベルでの魚類グランザイムの同定および特性解明を試みた。セリンプロテアーゼ特異的阻害剤である3,4-Dichloroisocoumarin(DCI)を用いた時に細胞傷害活性およびZ-GPR-MCA加水分解活性（グランザイムA様活性）の阻害が確認された。また、グランザイムA様活性はアロ抗原移植により上昇した。グランザイムA様活性を持つ酵素を精製した結果、分子量は26.9kDa，至適pH は 9.5であること、並びに哺乳類のグランザイムAと類似した基質特異性を有することがわかった。以上より、本酵素は哺乳類のグランザイムAに相当する機能を有することが示された。さらに、精製した酵素をコードする遺伝子を単離し顆粒球やマクロファージに発現する分泌型酵素であることを突き止めた。
2. 鰭膜内接種法による好中球機能測定法の開発：鰭膜内に投与した蛍光ビーズが長時間投与部位にとどまっていることが外部より観察することができた。ザイモザンを投与することにより鰭膜内へ好中球が遊走し、ザイモザンを貪食している様子を観察することに成功した。また、貪食好中球の割合をフローサイトメトリー解析により詳細に解析ができることを示した。鰭膜内にNBTを投与した結果、鰭膜の色が暗紫色に変化し、分離した好中球内においてNBTが活性酸素群により還元されることで生じる暗紫色のホルマザン顆粒が観察されたことから、生体内において呼吸バースト活性を解析することに成功した。以上より、生体内における好中球の機能解析手法の開発に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
細胞傷害活性に関与するグランザイム様酵素をギンブナ白血球より精製し、タンパク質レベルで酵素の特性を解析した。その結果、Z-GPR-MCAという基質を加水分解する哺乳類のグランザイムAに相当する酵素であること、並びに分子量や至適pHなどの特性を明らかにした。本酵素が加水分解する基質が明らかとなり、しかも酵素活性と細胞傷害活性が一致していることから、今後本酵素の活性値測定による簡便かつ鋭敏な細胞性免疫機能評価法の養殖魚への応用が期待される。
また、鰭膜内にザイモザンを投与することにより好中球の遊走、貪食を外部から観察することができることを示した。また、鰭膜内にNBTを投与することにより生体内における呼吸バースト活性を解析することに成功した。本年度は、免疫細胞の動態の外部からの観察を可能とし生体内で免疫機能を測定する技術の開発に成功した。このことにより、今後のリンパ球やマクロファージの解析への足場を築いた。
さらに、乳酸菌のEnterococcus faecalisの免疫賦活作用、特に細胞性免疫誘導能を明らかにし、今後細胞性免疫誘導アジュバントとしての活用の展望を示すなど、副次的な成果も得られた。
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| Strategy for Future Research Activity |
グランザイムの酵素活性に基づいた細胞性免疫機能測定法の開発において、細胞性免疫の優れたモデルとなっているギンブナを用いて、細胞傷害活性に関わる酵素及び遺伝子並びに加水分解する基質が明らかとなった。今後は、ブリ、ヒラメ、マダイなどの養殖上重要な魚種から同様な酵素を見出すことにより、細胞性免疫機能を簡便に測定する手法を開発する予定である。
リンパ球による殺菌活性を指標とした細胞性免疫機能測定法の開発においては、養殖現場において甚大な被害を及ぼしている細胞内寄生細菌に対する宿主免疫細胞による傷害機構を解明する。また、現在被害が増大しているが適切な対策が無い原虫（白点虫）に対する感染防御におけるT細胞の傷害機構について検討する。
鰭膜内接種法による細胞性免疫機能測定法の開発においては、好中球に注目して免疫細胞の動態の外部からの観察と生体内における免疫機能測定法の開発に成功した。そこで今後は、リンパ球やマクロファージの動態や機能解析法の検討を行い、細胞性免疫機能測定法の開発に結び付ける予定である。
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