Characterization of mutation as a marker for carcinogenesis induced by oxidative stress: identification of mutation hotspot

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16H05109
• Research Institution: National Institute for Environmental Studies
• Principal Investigator: 青木 康展 国立研究開発法人国立環境研究所, 環境リスク・健康研究センター, フェロー (20159297)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 續 輝久 九州大学, 医学研究院, 教授 (40155429) ; 野原 恵子 国立研究開発法人国立環境研究所, 環境リスク・健康研究センター, フェロー (50160271) ; 松本 理 国立研究開発法人国立環境研究所, 環境リスク・健康研究センター, 研究調整主幹 (60132867)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 変異原物質 / 酸化ストレス / 発がん / リスク評価 / 体内変異原性

Outline of Annual Research Achievements

１）酸化ストレス誘導剤投与による突然変異ホットスポットの誘発：　gpt遺伝子をゲノム上にもつMsh-OK gpt deltaマウスをMsh-KOマウスとgpt deltaマウスの交配により作出し、酸化ストレス誘導債として1.5 g/L KBrO3を4週間飲水経口投与した。投与終了後、滅菌水2週間飼育したのちに小腸上皮粘膜を採取し、酸化DNA付加体によるDNA損傷の修復機能が欠損している状態での突然変異誘発の解析に向けた準備を行った。予試験として、同様の酸化ストレス誘導剤として、亜ヒ酸Naや重クロム酸Naの投与実験を行った。86 mg/kgの亜ヒ酸Naを3週間オスC57BLマウスに混餌投与したが、小腸での腫瘍発生は認められなかった。また、重クロム酸Naを最高257.4 mg/Lの用量で28日間、および最高85.7 mg/Lの用量で90日間、オス gpt deltaマウスに飲水投与したが、小腸粘膜での突然変異頻度の上昇は見られなかった。
２）薬剤投与によらない酸化ストレスによる突然変異誘導の解析：　本年度は予試験として、2 g/L KBrO3をC57BLマウスに4週間飲水投与した後、2％ デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）を1週間さらに飲水投与し炎症を誘導した。酸化ストレスと炎症により小腸と大腸に腫瘍が発生することを期待しているが、投与終了後3か月後の解剖でも、腫瘍は観察されていない。
３）Msh2-KOマウスのエクソゾーム解析：　Msh2遺伝子欠損マウスの小腸に自然発生した腫瘍および小腸の腫瘍周辺の正常組織、また、基本的に器官形成後には細胞分裂を行わない状態の心臓からDNAを調製してエクソーム解析（対象塩基配列：50Mb）を行った。それぞれのサンプルでコールされた1000以上の変異サイトをフィルタリングした結果、腫瘍特異的変異として一塩基置換約800、欠失／挿入約500サイトが検出された。特にマイクロサテライト配列での数ユニットの増減が多数検出された。現在、変異サイトの配列特徴などの詳細な解析を進めている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

Msh2-KOマウスのついての実験は、概ね計画通りに研究は進捗している。期待していた亜ヒ酸Naや重クロム酸Naの投与による小腸で腫瘍の発生や突然変異の誘発は観察できなかった。また、炎症が誘導する酸化ストレスが誘発する消化管での突然変異誘発を観察できるよう検討を進めているが、その基本となる、デキストラン硫酸ナトリウム投与による腫瘍誘発の条件をさらに検討する必要がある。

Strategy for Future Research Activity

変異体gpt遺伝子をMsh2-KOマウス小腸のゲノムDNAから回収しDNA塩基配列を決定する。臭素酸カリウム投与あるいは非投与のマウスから回収した100クローン以上の多数の変異体gptを解析し、406番塩基（GAA配列中のG塩基）の‘G to T transv ersion’や他の酸化ストレスにより誘導された突然変異のホットスポットを同定する。同時に、臭素酸カリウム投与により誘導された腫瘍についてエクソソーム解析を行い、酸化ストレスによりゲノム上でどのような突然変異が発生したかを明らかにする。また、8-oxo-dGが生成されているDNA上の塩基を同定する新規の手法を導入して、406番塩基などの突然変異誘発のホットスポット上で、酸化ストレス剤の投与により8-oxo-dGの生成が上昇しているかを明らかにする。

Research Products

• [Journal Article] Evaluation of in vivo mutagenesis for assessing the health risk of air pollutants (2017)
  • Author(s): Yasunobu Aoki
  • Journal Title: Genes and Environment Volume: 39 Pages: 16
  • DOI: http://dx.doi.org/10.1186/s41021-016-0064-6
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Celecoxib and 2,5-dimethylcelecoxib inhibit intestinal cancer growth by suppressing the Wnt/β-catenin signaling pathway. (2017)
  • Author(s): Egashira, I., Takahashi-Yanaga, F., Nishida, R., Arioka, M., Igawa, K., Tomooka, K., Nakatsu, Y., Tsuzuki, T., Nakabeppu, Y., Kitazono, T., Sasaguri, T.
  • Journal Title: Cancer Sci. Volume: 108 Pages: 108-115
  • DOI: 10.1111/cas.13106
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] BUBR1 insufficiency in mice increases their sensitivity to oxidative stress. (2016)
  • Author(s): Matsuda, D., Matsumoto, T., Honma, K., Ikawa-Yoshida, A., Onimaru, M., Furuyama, T., Nakatsu, Y., Tsuzuki, T., Maehara, Y.
  • Journal Title: In vivo Volume: 30 Pages: 769-776
  • DOI: 10.21873/invivo.10993
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] BubR1 insufficiency impairs liver regeneration in aged mice after hepatectomy through intercalated disc abnormality. (2016)
  • Author(s): Ikawa-Yoshida, A., Matsumoto, T., Okano, S., Aoyagi, Y., Matsubara, Y., Nakatsu, Y., Tsuzuki, T., Ohkusa, T., Nomura, M., Onimaru, M., Furuyama, T., Maehara, Y.
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 6 Pages: 32399
  • DOI: 10.1038/srep32399
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Nucleotide excision repair of oxidised genomic DNA is not a source of urinary 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine. (2016)
  • Author(s): Evans, M. D., Misty, V., Singh, R., Gackowski, D., Rozalski, R., Siomek, A., Phillips, D. H., Zuo, J., Mullenders, L., Pines, A., Nakabeppu, Y., Sakumi, K., Sekiguchi, M., Tsuzuki, T., Bignami, M., Farmer, P. B., Olinski, R., Cooke, M. S.
  • Journal Title: Free Radic. Biol. Med. Volume: 99 Pages: 385-391
  • DOI: 10.1016/j.freeradbiomed.2016.08.018
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Presentation] Mutyh欠損マウスにおける酸化ストレスによる消化管腫瘍発生頻度上昇と特異的体細胞変異シグニチャーの解析 (2016)
  • Author(s): 鷹野典子、大野みずき、中津可道、中別府雄作、續輝久
  • Organizer: 日本分子生物学会第39回年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川）
  • Year and Date: 2016-12-02
• [Presentation] ヒト細胞由来ミスマッチ修復遺伝子変異体の作製とその解析 (2016)
  • Author(s): 林田元気、中津可道、日高京子、藤兼亮輔、日高真純、釣本敏樹、續輝久
  • Organizer: 日本分子生物学会第39回年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川）
  • Year and Date: 2016-12-02
• [Presentation] CRISPR/Cas9 を用いたDNAポリメラーゼδ R５０６H突然変異のMSH2-null HeLa MR 細胞への導入 (2016)
  • Author(s): 宋頴霞、日高京子、中津可道、織田信弥、林田元気、藤兼亮輔、日高真純、續輝久
  • Organizer: 日本分子生物学会第39回年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川）
  • Year and Date: 2016-12-02
• [Presentation] 環境変異原によって誘発された生体内突然変異の解析とそのリスク評価 (2016)
  • Author(s): 青木康展
  • Organizer: 日本環境変異原学会第45回大会
  • Place of Presentation: つくば国際会議場（茨城）
  • Year and Date: 2016-11-17 – 2016-11-18
  • Invited
• [Presentation] 過去の都市大気から採取した浮遊粒子抽出物がgpt deltaマウス肺で示す変異原性 (2016)
  • Author(s): 青木康展、中島大介、松本みちよ、松本理、柳澤利枝、後藤純雄、増村健一、能美健彦
  • Organizer: 日本環境変異原学会第45回大会
  • Place of Presentation: つくば国際会議場（茨城）
  • Year and Date: 2016-11-17 – 2016-11-18
• [Presentation] ミスマッチ修復欠損マウスを用いた新規生殖細胞変異の検出 (2016)
  • Author(s): 大野みずき、鷹野典子、佐々木史子、中津可道、續輝久
  • Organizer: 日本環境変異原学会第45回大会
  • Place of Presentation: つくば国際会議場（茨城）
  • Year and Date: 2016-11-17
• [Presentation] Development of assay systems to characterize the variants of mismatch repair factor MSH2 found in Lynch syndrome. (2016)
  • Author(s): Hayashida, G., Nakatsu, Y., Hidaka, K., Fujikane, R., Hidaka, M., Tsurimoto, T., Tsuzuki, T.
  • Organizer: The 10th International 3R (Replication, Recombination and Repair) Symposium
  • Place of Presentation: 島根県立産業交流会館（島根）
  • Year and Date: 2016-11-14
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Characterization of mismatch repair factor MSH2 variants found in Lynch syndrome. (2016)
  • Author(s): 林田元気、中津可道、日高京子、藤兼亮輔、日高真純、釣本敏樹、續輝久
  • Organizer: 日本放射線影響学会第59回大会
  • Place of Presentation: JMSアステールプラザ（広島）
  • Year and Date: 2016-10-27
• [Presentation] 酸化ストレスによる消化管腫瘍発生頻度上昇と特異的体細胞変異シグニチャー： Mutyh欠損マウスを用いた解析 (2016)
  • Author(s): 大野みずき、鷹野典子、中津可道、中別府雄作、續輝久
  • Organizer: 第75回日本癌学会学術総会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川）
  • Year and Date: 2016-10-07
• [Presentation] ヒト細胞を用いたミスマッチ修復因子MSH2の変異体の解析 (2016)
  • Author(s): 林田元気、中津可道、日高京子、藤兼亮輔、日高真純、續輝久
  • Organizer: 第75回日本癌学会学術総会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川）
  • Year and Date: 2016-10-07
• [Presentation] CRISPR/Cas9を用いたヒト細胞のミスマッチ修復因子への変異導入 (2016)
  • Author(s): 林田元気、中津可道、日高京子、 藤兼亮輔、日高真純、釣本敏樹、 續輝久
  • Organizer: 日本遺伝学会第88回大会
  • Place of Presentation: 日本大学国際関係学部（静岡）
  • Year and Date: 2016-09-09
• [Presentation] ミスマッチDNA修復系が体細胞および生殖細胞ゲノムにおよぼす影響 (2016)
  • Author(s): 鷹野典子、大野みずき、 佐々木史子、中津可道、續輝久
  • Organizer: 日本遺伝学会第88回大会
  • Place of Presentation: 日本大学国際関係学部（静岡）
  • Year and Date: 2016-09-09
• [Presentation] 体細胞と生殖細胞のゲノム維持における酸化損傷DNAの修復機構の重要性 (2016)
  • Author(s): 大野みずき
  • Organizer: 日本遺伝学会第88回大会
  • Place of Presentation: 日本大学国際関係学部（静岡）
  • Year and Date: 2016-09-06
  • Invited
• [Presentation] 食品健康影響評価における曝露量評価の重要性：アクリルアミドを例にして (2016)
  • Author(s): 青木康展
  • Organizer: 第43回日本毒性学会学術大会
  • Place of Presentation: ウインクあいち（愛知）
  • Year and Date: 2016-06-30 – 2016-07-01
  • Invited
• [Book] Thresholds of Genotoxic Carcinogens From Mechanisms to Regulation Chapter 10: Nrf2 as a possible determinant of the threshold for carcinogenesis (2016)
  • Author(s): Aoki, Y.
  • Total Pages: 210 （分担：pp. 155-170）
  • Publisher: Academic Press
• [Book] Thresholds of Genotoxic Carcinogens From Mechanisms to Regulation Chapter 4: Possible mechanisms underlining genotoxic thresholds: DNA repair and translesion DNA synthesis (2016)
  • Author(s): Nohmi, T., Tsuzuki, T.
  • Total Pages: 210 （分担：pp. 49-66）
  • Publisher: Academic Press
• [Remarks] 青木 康展 フェローが 日本環境変異原学会学会賞を受賞
  • URL: http://www.nies.go.jp/whatsnew/2017/20170224/20170224-1.html