2017 Fiscal Year Annual Research Report
Regulation of protease activities on the epithelial cell surface and its significance in epithelial disorders.
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16H05175
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| Research Institution | University of Miyazaki |
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Principal Investigator |
片岡 寛章 宮崎大学, 医学部, 教授 (10214321)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
竹田 直樹 熊本大学, 生命資源研究・支援センター, 助教 (90304998)
石田 洋一 明治薬科大学, 薬学部, 講師 (90510454)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | プロテアーゼ制御 / 腸管上皮細胞 / がん細胞浸潤性増殖 / HAI-2 / SPINT2 / HAI-1 / SPINT1 / 上皮完全性維持機構 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
上皮細胞膜上および細胞周囲微小環境におけるプロテアーゼ活性制御に重要な膜結合クニッツ型セリンプロテアーゼインヒビターであるHAI-1とHAI-2の研究を遂行し、以下の成果を得た。
1．条件付きHAI-2ノックアウトマウスを世界に先駆け作成し、生後6週での全身組織におけるspontaneous HAI-2 deletionの影響を観察した。その結果、HAI-2欠損によって腸管上皮と肝外胆道系上皮に明確な異常が出現し、腸管上皮機能障害によってマウスは短期間で致死となることが明らかになった。そこで、腸管上皮の変化を経時的に観察し、また腸管上皮を用いたオルガノイドの解析を行った。その結果、HAI-2欠損の結果Epcamの分解が亢進すること、また、小胞体ストレスと思われる超微形態変化が生じる事が明らかとなった。
2．培養ヒト細胞（表皮細胞1株、口腔扁平上皮癌細胞2株、大腸癌細胞1株）を用いてゲノム編集によりHAI-1もしくはHAI-2遺伝子をノックアウトし、その影響を解析した。その結果、表皮細胞や口腔扁平上皮癌細胞におけるHAI-2欠損は浸潤性増殖能を低下させること、そのうち浸潤能低下はプロスタシンの発現上昇に伴って生じている可能性があること、そして実際の口腔扁平上皮癌組織において浸潤性癌細胞ではHAI-2が発現亢進していることを見出し報告した。一方、HAI-1欠損は浸潤能を亢進させた。
3．膵癌組織を用いて、HAI-1の発現解析と予後との相関を解析した。その結果、HAI-1は膵癌細胞に広く発現しているが、発現が低下した領域を有する癌ではdisease free survivalが悪化する傾向があることを見出し報告した。
4．HAI-1とHAI-2の細胞内局在を決めるメカニズム、また標的プロテアーゼの一つであるマトリプターゼの局在と活性化に与える影響についての詳細な検証を開始した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1．条件付きHAI-2ノックアウトマウスの作成とその解析を順調に進め、その成果を論文としてまとめる段階にきている。また、その解析結果から、HAI-2の上皮細胞における重要な機能に関する新規の知見（小胞体およびゴルジにおけるプロテアーゼ活性管理機能の可能性）を得た。
2．ゲノム編集技術を用いて、HAI-1、HAI-2、および双方をノックアウトした数種類の培養細胞株を作成した。その表現型を解析しているが、その成果の一部（口腔扁平上皮癌細胞をもちいた解析）は論文として発表することが出来た。
3．HAI-1とHAI-2の細胞内局在と、それらが標的膜型プロテアーゼ（特にマトリプターゼ）の局在と活性に与える影響をin vitroで解析するための様々な変異コンストラクト作成を終了し、培養細胞を用いた検討を始めた。
4．膵癌におけるHAI-1発現の臨床病理学的解析を行い、その結果を論文として報告した。
以上のことから、おおむね順調に進展していると評価が出来る。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでに樹立したノックアウトマウス系統とその上皮オルガノイド、ノックアウト細胞株、さらには様々な変異コンストラクト発現ベクターを用いて、以下の検討を進める。
1．HAI-2が上皮細胞において、小胞体およびゴルジにおけるプロテアーゼ活性管理の役割を有し、これが腸管上皮細胞の正常機能維持において必須であるとする、我々の仮説を証明する。 また、細胞内でHAI-2が結合しているタンパク（プロテアーゼを推定しているがそれ以外の物も含め）を免疫沈降法および質量分析法によって同定する。
2．上皮完全性維持におけるHAI-1、HAI-2およびその標的タンパクの意義について、さらに検討を進め、新たな上皮完全性維持機構としての膜結合プロテアーゼインヒビターの生物学的意義を確立する。また、これらの細胞内局在を規定する分子メカニズムを明らかにする。
3．肝細胞癌、腎細胞癌、膠芽腫、メラノーマなどの明らかにHAI-2発現が低下している悪性腫瘍と膵癌や口腔扁平上皮癌のようにむしろHAI-2発現が亢進している悪性腫瘍におけるHAI-2の機能の相違について、標的プロテアーゼの観点から検討を進める。
4．HAI-1の腫瘍細胞浸潤抑制機能について、その分子メカニズムを更に検討する。
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[Journal Article] Hepatocyte growth factor activator inhibitor type-2 (HAI-2)/SPINT2 contributes to invasive growth of oral squamous cell carcinoma cells.2018
Author(s)
Yamamoto K, Kawaguchi M, Shimomura T, Izumi A, Konari K, Honda A, Lin C-Y, Johnson MD, Yamashita Y, Fukushima T, Kataoka H
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Journal Title
Oncotarget
Volume: 9
Pages: 11691-11706
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Journal Article] HAI-2 stabilizes, inhibits, and regulates SEA-cleavage-dependent secretory transport of matriptase.2017
Author(s)
Nonboe AW, Krigslund O, Soendergaard C, Skovbjerg S, Friis S, Andersen MN, Ellis V, Kawaguchi M, Kataoka H, Bugge TH, Vogel LK
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Journal Title
Traffic
Volume: 18
Pages: 378-391
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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