2017 Fiscal Year Annual Research Report
MST法による卵細胞質機能低下克服への挑戦：次世代への安全性の担保も目指して
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16H05468
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
立花 眞仁 東北大学, 大学病院, 講師 (30431571)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
志賀 尚美 東北大学, 大学病院, 助教 (20595558)
黒澤 大樹 東北大学, 医学系研究科, 非常勤講師 (20770192)
渡邉 善 東北大学, 大学病院, 助手 (40722567)
井原 基公 東北大学, 大学病院, 助教 (50403506)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 生殖医学 / 卵細胞質 / 核移植 / 配偶子系列遺伝子治療 / ミトコンドリア |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度の研究計画においては③細胞質移植によるレスキュー実験、④胚移植実験、および⑤次世代の検証を掲げており、C57/B6（B6）マウス雌20匹、雄8匹、B6D2F1（BDF1）マウス雌29匹、雄10匹を使用し、19周期の顕微操作実験、ICR雌マウス10匹を使用して2周期の胚移植を行った。
昨年に引き続き、 MST法の代替手段として前核期胚における大量細胞質移植（PN期大量細胞質移植：以下PNCT）に照準を合わせて手技の確立を目指した。顕微操作10回、使用前核期胚156個を使用し、媒精後6-10時間で異常受精胚（3前核胚等）の細胞質を正常授精胚へ移植し細胞癒合を行った。 まず内径の異なるピペットで直接ドナー細胞質の単離を試みたが、細胞質の破綻が約6割に生じた。そこで、卵子を脆弱な近交系B6から交雑群のBDF1へ変更し、2段階操作をおこなった。具体的にはドナーの異常胚からは小径ピペットにて前核と極体を除去し、レシピエントの正常授精胚からは極体のみを除去し1：2の割合で準備。その後大径ピペットにて細胞質移植を行ったところ、高い生存性を確認し、再構築胚は胚盤胞へ発育した。これまで9周期、240個の前核期胚を使用、胚盤胞到達率の平均は対照群、PNCT群それぞれ49.48％と66.39％（P=0.28）であり、統計学的に差を認めなかった。PNCT胚の安全性の検証としては、胚移植による産仔回復と次世代の作出を試るため2周期の胚移植を完了しているが、まだ満期に達していないため産仔は得られていない。他の胚盤胞はATP測定（６６個）、ミトコンドリア遺伝子コピー数解析（１０個）を現在行っている。
細胞質機能低下卵子のモデルとしては、B6マウス卵子を用いてFCCPの濃度決定を行って100ｍMで対照群と比較して胚発育が阻害されることを見出している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
細胞質移植方法が確立しPNCTにて安定した胚発育が得られている。PNCT胚の胚発育はコントロールと同等であり、現在移植による産仔の回復も見込んでいる。ミトコンドリアコピー数解析については、すでにサンプリングを終了しているため、全ゲノム増幅（WGA）や定量PCR測定を行って、細胞質移植胚におけるミトコンドリア遺伝子コピー数の増加を確認する段階に至っている。
細胞質機能低下の方法としてMST法からPNCTへ変更しているが、細胞質の移植による低細胞質機能卵子のレスキューの試みとしての目的は変わらない。また、他個体からの卵子（若い卵子）提供を必要とするMST法とは異なり、PNCTは①自身の異常受精胚（廃棄される胚の細胞質）をドナーとして量的レスキューを行う方法と、②細胞周期の一致した他者の廃棄される前核期胚（異常受精胚もしくは、凍結廃棄前核期胚）の細胞質を用いた量的、質的レスキューのいずれも可能である。いずれのケースでも本法のために健常卵子ドナーを必要とせず、廃棄される胚の細胞質を利用するという点で倫理的にも優れている可能性がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在のところ、正常胚を利用した検討でコントロールと遜色のない胚発育を確認している。正常胚ではもともと胚盤胞発育が良好であるため、今後は①低細胞質機能卵子（卵管内加齢卵や薬剤によるミトコンドリア阻害）を用いた検討で、そのレスキュー効果を確認する。また、②移植された細胞質による効果の細胞分子学的検討や、③次世代の生殖能力の検討も行っていく。
①においては細胞質の排卵後加齢卵子に加えて、ミトコンドリア 脱共役薬（FCCP）による機能低下卵子を開始する。まず自己の異常受精胚をドナーとしたPNCTの検討を行い、量的レスキュー効果を検証する。その後に、他者（正常）の前核期胚細胞質をドナーとした検討として、低細胞質機能胚へコントロール胚の細胞質を移植して胚発育を検証する。②移植された細胞質の効果の検討としては胚盤胞期のATP含量、ミトコンドリア遺伝子コピー数の増加を検証する。上記２項目で検討が困難な場合にはミトコンドリアハプロタイプの異なるC3H/HeNマウスの前核期胚細胞室をBDF1前核期胚へ移植し定量PCRにて移植された細胞質の定量的証明を行う。③は今年度最後に移植した胚の産仔を確認。産仔が得られない場合には追加の移植実験を行って産仔を獲得し、産仔は交配を行って生殖能力の確認も行う。また、低細胞質機能卵子の胚盤胞とPNCTレスキュー胚についても、実験毎に十分な移植胚数の確保が可能であれば胚移植を行って着床数（ 正常胎児/着床痕）の検討も予定している。
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| Remarks |
東北大学リプロダクションホームページ、研究紹介
http://www.ob-gy.med.tohoku.ac.jp/patient/rep_research.html
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Research Products
(7 results)
