2017 Fiscal Year Annual Research Report
婦人科がんの個別化腫瘍免疫療法を目指した腫瘍浸潤リンパ球の基礎的研究
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16H05472
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
吉川 史隆 名古屋大学, 医学系研究科, 教授 (40224985)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
梶山 広明 名古屋大学, 医学系研究科, 准教授 (00345886)
鈴木 史朗 名古屋大学, 医学部附属病院, 講師 (20612758)
中面 哲也 国立研究開発法人国立がん研究センター, 先端医療開発センター, 分野長 (30343354)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 婦人科がん / 腫瘍免疫 / 腫瘍浸潤リンパ球 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
婦人科がんにおける患者由来腫瘍のin vivoモデル（Patient-derived xenograft: PDXモデル）の構築と腫瘍浸潤リンパ球（Tumor Infiltrating Lymphocytes: TIL）の基礎的検討を引き続き行った。本年度では、希少婦人科がん症例のPDX細胞株の樹立、婦人科がん患者の腫瘍から分離・培養したTILの増殖効率やpopulationおよび腫瘍応答性の解析を中心に研究を進めた。
TIL培養法に関しては、2mm大の腫瘍組織を24well plateの各wellに播き高濃度IL-2を添加したTIL培養液で約2週間培養した。TIL培養を行った35症例にて、回収・保存できた細胞数は計0.2-23x100万個（中央値100万個）と幅があり、培養前のTIL数の多寡に左右されると考えられた。TILのフェノタイプ(CD8, CD4等）の解析をフローサイトメトリー（FACS）にて行ったところ、CD8陽性細胞の割合は中央値で38.6%であった。
PDXモデルに関しては、2mm大ほどに細断した腫瘍細胞塊や腹水由来細胞を用いて、超免疫不全マウス（NSGマウス）の皮下・腎被膜下への移植もしくは腹腔内に注射し腫瘍細胞の生着・増殖の確認を行った。婦人科がん35例（卵巣がん26例、子宮頸がん5例、子宮体がん1例、卵管がん1例、卵巣がん+子宮体がん1例、絨毛癌1例）についてPDXモデルの作製を試み、うち13例で初代腫瘍生着に成功した。2継代以上の腫瘍増殖が確認できた症例は8例の状況であるが、継代するにつれ腫瘍形成に要する期間が短縮する傾向がみられた。そのうちの複数例で、病理組織学検討にて移植元の形態が継代後も維持されていることが確認された。
同一患者由来でTILの分離・培養とPDXモデルの樹立が可能であった数症例に関して、TILの腫瘍反応性をFACSにて確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
PDXモデルに関しては、NSGマウスへの移植後初代腫瘍の生着までに概ね40-60日程度である症例が多いが150日超の場合もあり長期間の飼育が必要である。2代目以降の継代後の腫瘍形成に要する期間は短縮傾向ではあるものの、in vivo継代が安定して可能である株化に成功したかどうかの判断には2継代以上の生着・増殖確認と病理学的評価を行っており、さらに長期間を要している状況である。
培養後のTILについては、フェノタイプ（CD8・CD4等）のFACS解析だけでなく、抗腫瘍応答の検証実験を行った。同実験では、Effector細胞として培養されたTILからMACSを用いてCD8陽性細胞を単離し、Target細胞としてはPDX腫瘍を分散処理し使用した。E/T細胞比2:1で共培養しCD8陽性細胞の表面マーカー（CD107aやPD-1等）のFACS解析を行ったが、TIL培養効率に患者の手術時の状態や組織型ごとによって幅が生じているため、TIL培養症例数に対しては少数例での検討に留まっておりやや遅れている。対策として、培養で得られるTILが少ないことが予想される組織型については培養量を追加している。同一患者由来のTIL・PDX株セットが十分にそろっていないことも遅れの原因であるため、手術検体が比較的多く得られた症例に関してはex vivoでも同様の解析を行っていく計画とした。
がん細胞が提示しているペプチド候補の探索に関しては、検体条件が整った4症例を選択し、がん組織の一部と非がん組織の一部から抽出したDNA・RNAを用いた次世代シーケンサーでの解析へと進めている状況である。
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| Strategy for Future Research Activity |
同一患者由来でTILの分離・培養とPDXモデルの樹立が共に可能であった症例を優先して、以下の実験を進める。
・TILのpopulation解析（FACS）
・樹立されたPDX腫瘍の病理組織学的解析：オリジナルの婦人科腫瘍標本と病理学的に比較し類似性および差異について評価する。
・がん細胞が提示しているペプチド候補の探索
1)遺伝子変異に由来するペプチドの同定…がん切除検体から、がん組織の一部と非がん組織の一部から抽出したDNA・RNAを用いた次世代シーケンサーでの解析から、がん部と非がん部のゲノムシーケンスの差引によって患者ごとのがん特異的体細胞遺伝子変異を同定する。同定した遺伝子変異によって、アミノ酸配列が変わると予想される部位を中心に候補ペプチドをデザインする。25アミノ酸程度のロングペプチをコードするmRNAを合成し、別途培養しておいた同一患者由来の線維芽細胞に導入し、線維芽細胞のプロテアソームにプロセスさせHLA classⅠに提示されたペプチドに対するTILの認識抗原を同定していく予定である。本手法ではNetMHC等の結合予測を使用せずに提示されたペプチドをスクリーニングすることが可能であり、腫瘍反応性の高いペプチドやTCRの同定を行うことで、どのような抗原が腫瘍排除に強く関与しているかを検討する。
2) がん細胞固有の自己抗原由来のペプチドの同定…がん切除検体から抗HLA classⅠ抗体での免疫沈降法を行いHLA class I-ペプチド複合体を抽出する。HLA class Ⅰ分子に結合した抗原ペプチドを直接、酸処理でHLA class Ⅰ分子から解離させ溶出させる。LC-MS、MALDI-TOF-MSを使用しペプチドのアミノ酸配列を決定する（プロテオーム解析）。複数の症例で同定が可能であったペプチドについて解析を行う。
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