2017 Fiscal Year Annual Research Report
Japan Original Cancer Gene Therapy by Inhibition of Multiple Molecules Using Decoy Strategy
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16H05513
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| Research Institution | Kanazawa Medical University |
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Principal Investigator |
石橋 浩晃 金沢医科大学, 医学部, 准教授 (90254630)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
鬼丸 満穂 九州大学, 医学研究院, 助教 (00380626)
中山 英二 北海道医療大学, 歯学部, 教授 (60172467)
杉本 直俊 金沢大学, 医学系, 准教授 (80272954)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 悪性新生物 / 遺伝子治療 / 血管新生 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本戦略では，おとり遺伝子，すなわち20塩基対ほどの合成二本鎖オリゴヌクレオチドを核内に大量に発現させて遺伝子導入する．そのために申請者らが独自に開発したHemagglutinating virus of Japan((HVJ）を用いたHVJ-リポソーム法を用いる．本法は，まず極めて細胞融合能の強いHVJ を紫外線(UV) を照射してゲノムRNAを不活化して，ウイルス外套蛋白の膜融合能だけを保持・活動させる．また，おとり遺伝子を封入したリポソームを調整し厳重な温度管理により不活化したHVJ と融合させ，おとり遺伝子を大量に封入するHVJ-リポソームを作成するその後，癌細胞と膜融合させる事で，大量のおとり遺伝子を癌細胞に導入することが可能である．
①HVJ-リポソーム法による遺伝子導入法の確立：受精鶏卵を用いたHVJの大量培養法とHVJ-リポソーム調整法を確立した．また，おとり遺伝子への核移行蛋白の付加により，導入したおとり遺伝子は導入後３時間で，癌細胞の核内に移行していることを観察した．また，本研究課題の最重要目的である動物モデルによるおとり遺伝子導入の抗腫瘍効果の検証のために，培養細胞への遺伝子導入条件を参考に，動物モデルを用いた実験的腫瘍における，至適遺伝子導入法を確立した．
②HVJ-リポソーム法を用いたおとり遺伝子導入による，血管新生因子発現の抑制効果の解析：培養口腔癌細胞にHVJ-リポソーム法を用いておとり遺伝子を導入し，サイトカインや増殖因子による刺激，あるいは低酸素や低栄養で培養し，血管新生因子群の発現に関する抑制効果を検索する．また，本遺伝子治療法の効果を動物モデルによる実験的腫瘍に与える抗腫瘍効果で検証し，臨床応用に際しての基礎的資料を蓄積した．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
癌細胞の細胞増殖はさまざまな種類の増殖因子や血管新生因子とその受容体によって制御されており，細胞の正常な増殖からの逸脱が，細胞の悪性形質の獲得へつながることが知られている．口腔SCCはEGFやEGFRの高発現がみられることを検証した．また，腫瘍組織における未分化間葉系細胞におけるEGFRの過剰発現は，細胞遊走に関連し，EGFは基質破壊酵素産生に重要な役割を担っていることを解析した．本研究では，腫瘍組織における未分化間葉系細胞においてEGFRの高発現を認め，またこれらの細胞では，in vitroにおけるマトリゲルへの遊走がEGF反応性に認められた． EGF反応性の細胞浸潤の増加は，EGFRの過剰発現に依存していることを究明した．
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| Strategy for Future Research Activity |
HVJ-リポソーム法によるおとり遺伝子導入の利点は，標的とした転写因子が関与する遺伝子群の全ての発現を同時に抑制できる事である．申請者は現在までに培養口腔癌細胞を用いて，多彩な転写因子群（AP-1，NF-kB，Ets-1，HIF-1）の転写活性を検討しており，その一例として転写因子AP-1はEGF共存下や低酸素環境により，VEGFだけでなく，癌の浸潤・転移に関与する基質破壊酵素のうちuPA，uPARの発現誘導にも関与していることを検証する．さらに培養癌細胞においてAP-1に対するおとり遺伝子を導入すると，血管新生因子だけでなくuPA発現の同時抑制を解析する．これは，おとり遺伝子導入は標的転写因子の抑制により，血管新生だけでなく癌細胞の増殖や転移など，当該転写因子が関与する 全ての遺伝子を同時に制御できる事を裏付ける結果となる．このように癌細胞の活性の広範囲な阻害により極めて強い抗腫瘍効果を示す事が期待でき，おとり遺伝子導入の総括的な抗腫瘍効果を検証する．
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