2017 Fiscal Year Annual Research Report
リン酸化酵素フォールディング中間体を新規標的とした革新的創薬技術基盤の構築
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16H05926
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
喜井 勲 国立研究開発法人理化学研究所, 科学技術ハブ推進本部, ユニットリーダー (80401561)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | DYRK1A / リン酸化酵素 / フォールディング / ATP / 自己リン酸化 / 中間体 / 阻害剤 / スクリーニング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、DYRK1Aフォールディング中間体阻害の分子機序を解明し、その成果を活用して、化合物ライブラリを対象とした中間体阻害剤スクリーニングを実施する。この一連の技術基盤を活用し、他のリン酸化酵素のフォールディング中間体が触媒する自己リン酸化を特異的に阻害する化合物を探索することで、創薬の課題解決に取り組む。平成29年度は、以下の二つの項目の研究を実施した。
項目2：DYRK1Aフォールディング中間体を標的とした化合物スクリーニング 平成28年度に明らかにしたDYRK1A必要最小領域を活用したin vitro翻訳・自己リン酸化カップリング系を構築した。この評価系の有効性をFINDYなどの既知阻害剤を用いて実証し、小規模化合物ライブラリを対象としたスクリーニングを実施した。さらにハイスループット化を進めるため、検出系の高感度化を進めた。また、DYRK1A活性ドメインに存在する、リン酸化酵素活性に関与することが示唆されているアミノ酸残基のうち、どの領域が自己リン酸化に関与するかを点変異導入により解明し、基質リン酸化と自己リン酸化の構造的な違いについての知見を得た。
項目3：ヒット化合物の構造展開 項目2の評価系を用いて、化合物スクリーニングを実施し、既知の化合物の中から、中間体特異的阻害剤へと構造展開可能なものを選別した。この化合物、及び、FINDY構造類縁体のドッキングシミュレーション・共結晶構造解析などを実施し、FINDYの結合するフォールディング中間体構造を予測した。この構造予測を元に、中間体特異的阻害剤への変換の化合物構造設計を行い、そのライブラリ化に向けた合成準備を進めた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成29年度は、平成28年度に遅れていた化合物スクリーニングを実施し、既知の化合物ではあるが、中間体特異的阻害剤へと構造展開可能な化合物を同定でき、項目3のヒット化合物の構造展開へと進めることができるようになった点を踏まえ、「おおむね順調に進展している」と判断した。またスクリーニング評価系については、さらなるハイスループット化を目的とした改善を平成30年度も進め、最終的には大規模化合物ライブラリを対象としたスクリーニングを実施可能なレベルへと改良する予定である。
また、これまでに他のリン酸化酵素において必要とされてきた活性ドメインのアミノ酸残基について、点変異の導入を行い、その自己リン酸化における必要性を解析した。その結果、基質リン酸化と自己リン酸化は、活性ドメインのアミノ酸残基においては、必ずしも一致せず、その反応機構に違いがあることが明らかになった。これは自己リン酸化を特異的に阻害するFINDYの存在からも予測されていたが、さらに分子生物学的な実験からも支持される結果となった。
さらに、フォールディング中間体の構造を予測するため、いくつかのFINDY構造類縁体については結晶構造解析に取り組み、その構造を解くことに成功した。この解析結果は、平成30年度に実施する化合物構造展開において極めて有効であり、論理的な構造設計が可能になると期待される。しかし一方、FINDYとDYRK1Aの構造解析には難航しており、さらなるブレイクスルーが必要であると考えられる。本研究の項目3では、新規のDYRK1Aフォールディング中間体特異的阻害剤の同定を目指しており、この新規の化合物であれば、中間体の構造解析が可能になる可能性もあり、今後のさらなる研究が重要である。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成30年度は、以下の二つの項目の研究を実施し、DYRK1Aフォールディング中間体を標的としたハイスループット阻害剤スクリーニング系の構築、新規フォールディング中間体特異的阻害剤の同定、フォールディング中間体の自己リン酸化の分子・構造基盤の解明を目指す。
項目2：DYRK1Aフォールディング中間体を標的とした化合物スクリーニング in vitro翻訳・自己リン酸化カップリング系のさらなるハイスループット化を進め、大規模化合物ライブラリを対象としたスクリーニングを実施するための実験系の構築を進める。具体的には、検出系の高感度化・定量化により、マルチウェルプレートでの評価が可能となるシステムの構築を進める。また、DYRK1A活性ドメインにあるアミノ酸残基の機能解析を進め、基質リン酸化と自己リン酸化の構造的な違いを明らかにし、フォールディング中間体と規定する分子基盤を解明する。
項目3：ヒット化合物の構造展開 検討を進めたヒット化合物からの構造展開の設計に基づいて化合物合成を実施し、新規フォールディング中間体特異的阻害剤の取得を目指す。また、これまでに同定した化合物、及び、新規に得られた化合物を活用した構造解析を実施し、フォールディング中間体の構造解析に挑戦する。これらの成果、またシミュレーションなどを取り入れることで、フォールディング中間体の構造基盤を解明する。
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