2016 Fiscal Year Annual Research Report
ゲノムに局在するユビキチン様修飾分子Ufm1による生活習慣病防御機構の解明
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16H06221
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
渡部 昌 北海道大学, 医学研究科, 助教 (10632424)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ユビキチン様修飾分子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
①レトロウイルスベクターを用いて、Ufm1ノックダウンHEK293T細胞株を樹立した。
②Ufm1ノックダウンHEK293T細胞、コントロールHEK293T細胞を細胞質、核質、クロマチンの各分画に分け、Ufm1抗体を用いたウエスタンブロット法を行い、Ufm1がクロマチン分画に多く分布していることを見出した。
③HEK293T細胞株を用いて、クロマチン免疫沈降処理の条件検討を行った。具体的には、HEK293T細胞をDSGまたはホルムアルデヒドにて固定後、核分画を抽出し、溶解バッファーにて溶かした後に、Picoruptorによる超音波破砕によってクロマチンを断片化、抗体によってクロマチン免疫沈降処理を行った。各ステップで複数の条件を検討し、クロマチン免疫沈降に最適なクロマチン断片化条件を見出した。
④Ufm1ノックダウンHEK293T細胞、コントロールHEK293T細胞を用いて通常条件下、小胞体ストレス誘導条件下で培養後に回収し、上記で検討した最適な条件でクロマチン免疫沈降処理を行った。調製したサンプルを用いてクロマチン免疫沈降シークエンス解析を行い、ゲノム上のUfm1分子局在部位を同定した。
⑤Ufm1ノックダウンHEK293T細胞、コントロールHEK293T細胞を用いて通常条件下、小胞体ストレス誘導条件下で培養後に回収し、RNAを抽出した。調製したサンプルを用いてRNAシークエンス解析を行い、発現が変動する遺伝子群を同定した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度に計画していた実験が概ね遂行できており、今年度に得られた知見を元に来年度もさらに研究を進展させる段階にあるため。
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| Strategy for Future Research Activity |
樹立予定であったUfm1ノックダウン細胞株のうち、一部について樹立が成功していない。用いた細胞が樹立が難しい細胞株であると思われたため、同種の他の細胞株での樹立を検討中である。
その他については概ね計画通りに遂行されているため、現在のところ変更はない。
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[Journal Article] The novel heart-specific RING finger protein 207 is involved in energy metabolism in cardiomyocytes.2016
Author(s)
Mizushima W, Takahashi H, Watanabe M, Kinugawa S, Matsushima S, Takada S, Yokota T, Furihata T, Matsumoto J, Tsuda M, Chiba I, Nagashima S, Yanagi S, Matsumoto M, Nakayama K, Tsutsui H, Hatakeyama S
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Journal Title
J. Mol. Cell. Cardiol.
Volume: 100
Pages: 43-53
DOI
Peer Reviewed
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