ゲノムに局在するユビキチン様修飾分子Ufm1による生活習慣病防御機構の解明

• Project/Area Number: 16H06221
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Environmental physiology(including physical medicine and nutritional physiology)
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 渡部 昌 北海道大学, 医学研究院, 講師 (10632424)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2020-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2019)
• Budget Amount: ¥25,090,000 (Direct Cost: ¥19,300,000、Indirect Cost: ¥5,790,000); Fiscal Year 2019: ¥6,110,000 (Direct Cost: ¥4,700,000、Indirect Cost: ¥1,410,000); Fiscal Year 2018: ¥6,110,000 (Direct Cost: ¥4,700,000、Indirect Cost: ¥1,410,000); Fiscal Year 2017: ¥6,110,000 (Direct Cost: ¥4,700,000、Indirect Cost: ¥1,410,000); Fiscal Year 2016: ¥6,760,000 (Direct Cost: ¥5,200,000、Indirect Cost: ¥1,560,000)
• Keywords: Ufm1 / ゲノム / クロマチン / ユビキチン様修飾分子

Outline of Annual Research Achievements

①FLAG-UFM1発現細胞株の樹立：CMVプロモーターの下流にFLAG-UFM1を組み込んだレトロウイルスベクターを作製した。このベクターを用いてレトロウイルスを作製し、FLAG-UFM1安定発現HEK293T細胞株を樹立した。同様にして、FLAG-UFM1安定発現MCF7細胞株を樹立した。
②質量分析によるUFM1化タンパク質の同定：HEK293T細胞株を用いて、1%SDSを含む溶解バッファーで溶解後に90℃で10分間加熱して変性し、FLAG-UFM1と他の分子の共有結合以外の相互作用を破壊した。SDSを含んでいない溶解バッファーで10倍希釈後に抗FLAG抗体を用いて免疫沈降することでUFM1と共有結合したタンパク質のみを精製し、質量分析器による解析を行った。この結果、約100個のUFM1化タンパク質候補を得た。これらの中には、過去に基質として報告されているUBA5、UFC1、DDRGK1などが含まれていた。また、MCF7細胞株を用いて、同様に溶解後に変性し、抗FLAG抗体を用いて免疫沈降してUFM1と共有結合したタンパク質のみを精製し質量分析器による解析を行ったところ、約90個のUFM1化タンパク質候補を得た。多くはHEK293T細胞での結果と一致しており、UBA5、UFC1、DDRGK1といった既知の基質も含まれていた。また、これらの分子群の中には、転写制御因子が複数含まれていた。
③実際に一部の分子について細胞内でのUFM1化を検証し、実際にUfm1化を受けていることを確認した。
④ChIP-seq解析時のさらなる条件検討を行い、より最適な条件を見出した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

計画していた実験が概ね遂行できており、今年度に得られた知見を元に来年度もさらに研究を進展させる段階にあるため。

Strategy for Future Research Activity

ChIP-seq解析におけるよりよい条件を評価し、現時点で最適な条件を見出した。この条件を元に、さらに詳細なChIP-seq解析を行う。
その他についてはおおむね計画通りに遂行されているため、現在のところ変更はない。

Research Products

• [Journal Article] Mutations in bassoon in individuals with familial and sporadic progressive supranuclear palsy- like syndrome. (2018)
  • Author(s): Yabe I, Yaguchi H, Kato Y, Miki Y, Takahashi H, Tanikawa S, Shirai S, Takahashi I, Kimura M, Hama Y, Matsushima M, Fujioka S, Kano T, Watanabe M, Nakagawa S, Kunieda Y, Ikeda Y, Hasegawa M, Nishihara H, Ohtsuka T, Tanaka S, Tsuboi Y, Hatakeyama S, Wakabayashi K, Sasaki H
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 8 Pages: 819-819
  • DOI: 10.1038/s41598-018-19198-0
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Anti-Sez6l2 antibody, detected in a patient with immune-mediated cerebellar ataxia, inhibits complex formation of GluR1 and Sez6l2. (2018)
  • Author(s): Yaguchi, H., Yabe, I., Takahashi, H., Watanabe, M., Nomura, T., Kano, T., Watanabe, M. and Hatakeyama, S.
  • Journal Title: J. Neurol. Volume: 265 Pages: 962-965
  • DOI: 10.1007/s00415-018-8785-z
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Sez6l2 regulates phosphorylation of ADD and neuritogenesis. (2017)
  • Author(s): Yaguchi, H., Yabe, I., Takahashi, H., Watanabe, M., Nomura, T., Kano, T., Matsumoto, M., Nakayama, K.I., Watanabe, M. and Hatakeyama, S.
  • Journal Title: Biochem Biophys Res Commun Volume: 494 Pages: 234-241
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2017.10.047
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Fine-tuning of thymocyte development by ubiquitination-mediated stability control of the ESCRT protein CHMP5. (2017)
  • Author(s): Watanabe, M. and Hatakeyama, S.
  • Journal Title: Cell. Mol. Immunol. Volume: 14 Pages: 957-959
  • DOI: 10.1038/cmi.2017.91
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] TRIM proteins and diseases (2017)
  • Author(s): Watanabe, M. and Hatakeyama, S
  • Journal Title: J. Biochem. Volume: 161 Pages: 135-144
  • DOI: 10.1093/jb/mvw087
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] The novel heart-specific RING finger protein 207 regulates energy metabolism in cardiomyocytes (2016)
  • Author(s): Mizushima, W., Takahashi , H., Watanabe, M., Kinugawa, S., Matsushima, S., Takada, S., Yokota, T., Furihata, T., Matsumoto, J., Tsuda, M., Chiba, I., Nagashima, S., Yanagi, S., Matsumoto, M., Nakayama, K.I., Tsutsui, H. and Hatakeyama, S.
  • Journal Title: Journal of Molecular and Cellular Cardiology Volume: 100 Pages: 43-53
  • DOI: 10.1016/j.yjmcc.2016.09.013
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] p53 represses the transcription of snRNA genes by preventing the formation of little elongation complex. (2016)
  • Author(s): Anwar, D., Takahashia, H., Watanabe, M., Suzuki, M., Fukuda, S., Hatakeyama, S.
  • Journal Title: BBA Gene Regulatory Mechanisms Volume: 1859 Pages: 975-982
  • DOI: 10.1016/j.bbagrm.2016.06.001
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] Identification of E3 ligase substrates by fusion of TR-TUBE and ligase trap methods. (2017)
  • Author(s): Watanabe M
  • Organizer: Cold Spring Harbor Laboratory Meeting on the Ubiquitin Family
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] The E3 ubiquitin ligase TRIM23 regulates adipocyte differentiation via stabilization of the adipogenic activator PPARγ (2016)
  • Author(s): 渡部 昌, 高橋秀尚, 畠山鎮次
  • Organizer: 第39回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川県・横浜市）
  • Year and Date: 2016-12-01
  • Invited
• [Presentation] ユビキチンリガーゼTRIM23は非定型ポリユビキチン化によるPPARγの安定化を介して脂肪細胞分化を制御する (2016)
  • Author(s): 渡部 昌, 高橋秀尚, 畠山鎮次
  • Organizer: 第89回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 東北大学川内北キャンパス （宮城県・仙台市）
  • Year and Date: 2016-09-27
• [Presentation] ユビキチンE3リガーゼTRIM23は非定型ポリユビキチン化によるPPARγの安定化を介して脂肪細胞分化を制御する (2016)
  • Author(s): 渡部 昌, 高橋秀尚, 畠山鎮次
  • Organizer: 第68回日本細胞生物学会大会
  • Place of Presentation: 京都テルサ（京都府・京都市）
  • Year and Date: 2016-06-15
• [Presentation] ユビキチンリガーゼTRIM23はPPARγの安定化を介して脂肪細胞分化を制御する (2016)
  • Author(s): 渡部 昌, 高橋秀尚, 畠山鎮次
  • Organizer: 第89回日本内分泌学会学術総会
  • Place of Presentation: 国立京都国際会館（京都府・京都市）
  • Year and Date: 2016-04-21
• [Book] Advances in Medicine and Biology. Volume 120 (2017)
  • Author(s): Masashi Watanabe and Shigetsugu Hatakeyama
  • Total Pages: 23
  • Publisher: Nova Science Publishers